Le 24 novembre 2011
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Le 24 Novembre 2011. Cours de chromatographie d ’ exclusion Professeur SAALAOUI Ennouamane. CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION. FILTRATION. TAMISSAGE MOLECULAIRE. Chromatographie par perm é ation de gel. C hromatographie dexclusion - diffusion. C hromatographie dexclusion – de taille.

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Presentation Transcript
Le 24 novembre 2011
Le 24 Novembre 2011

Cours de chromatographie d’exclusion

Professeur SAALAOUI Ennouamane


CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION

FILTRATION

TAMISSAGE MOLECULAIRE

Chromatographie par perméation de gel

Chromatographie dexclusion -diffusion

Chromatographie dexclusion –de taille

généralement

Chromatographie d’exclusion stérique

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


Perméation de gel

Chimie macromoléculaire

Phase mobile est de nature organique

Filtration sur gel

Biopolymères commeprotèines

La phase mobile est aqueuse

Chromato d’exclusion de taille

Silices greffées et non des gels

Chaînes poly-2hydroxyméthyl aspartamide

Bcp de NH2 , OH , CO caractère hydrophile

Liaisons hydrogènes crée des ponts des chaînes polyaspartamide

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


Le principe de la chromatographie d’exclusion

  • Le tamissage moléculaire (pores)

  • Séparation en fonction de la taille

  • -Le chemin parcouru par les molécules dépend de leur taille

  • Les plus grandes s’excluent

  • Les plus petites s’inclusent

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012



liaison a1-6

et 1-4

dextrane (polymères de glucose) des ponts

1959 Branchement

+

Réseau + ou - serré

SéphadexG10, G15, G200

Degré de réticulation décroissant

Mailes + en+ grandes

Le choix en fct de la taille des molécules à séparer

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


V liaison P

VS

Vo

VP

VS

VS

VP

Principe de l’exclusion

Vo= Vm

Vi= Vp

Vs = VG

VT = Vo + Vp + Vs

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


Diff rents volumes sur le chromatogramme

Vo = volume mort = Vm liaison

Vp =volume des pores

Vs =volume interne

=Vg

VP

Vp

Vo

Vs

VS

Vo

VP

VS

VS

VR

VT

Vo

VP

Vc

Différents volumes sur le chromatogramme

Vc = Vo + VP + VS

VT = Vo + VP

Volume de la colonne

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log PM liaison

0 f 1

Ou Ve

VR

Vo

VP

VC = Vo + VP + VS VT = Vo + VP

VS est négligeable

VT = Vc

f = fraction des pores

VR = Vo + VP f . K .

1-0

f=0

Si K=1 molécules diffusent bien

VR = Vo + VP f .

Si f=0 molécules totalement exclues

VR = Vo

f=1

Si f=1 molécules incluses

VR = Vo + VP

Volume de diffusion totale

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


V liaison R VT forte inclusion

Si K 1 ceci signifie

VR = Vo + VP f . K .

D’autres phénomènes que l’exclusion

Adsorption ou Échange ionique

Cas des substance aromatiques avec les gels de dextarn

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


K .f liaison

(Vo-VR(=

Vp

Si K= O

VR = Vo + VPf . K.

Molécules complètement exclues

Available accessible

Kav = VR-VO

Vp + VG

VT = Vo + VP + VG

VP + VG= VT - Vo

Kav = Vp

Vp + VG

= Kav Vo-VR

VT – Vo

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f=0 liaison

f 1

f=1

1

2

Rs = ¼(a-1)/a . k2/(1+k2). N21/2

Efficacité de la colonne

a = TR2– To

La résolution

Influence de la capacité

To – 1TR

La sélectivité

Rétention relative

Distribut° des 2 S

-porosité du gel

-taille des S

-uniformité des f des pores

La sélectivité

Rétention relative

Distribution 2 S

-porosité du gel

-taille des S

-uniformité des f des pores

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f=0 liaison

log PM

Exclusion

Domaine exploré

Diffusion totale

Inclusion

f=1

k = K . Vs/VM

Vs = f. Vp

En chromato d’exclusion le K est tj voisin de 1 ; k entre 0,5 et 3

k = Vs/VM

Vs volume des pores accessibles

VM volume extragranulaire

Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


V liaison p

Vo

Vs

Rs = ¼(a-1)/a . k2/(1+k2). N21/2

Le R augmente en même temps que k

Au delà de 5 à 10, la résolution ne varie pas

H = L/N

N = 16 (TR/ w)2

w

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Aspects pratiques
Aspects pratiques liaison

  • Sur couche mince

  • colonne

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Caract ristiques des phase stat
Caract liaison éristiques des Phase stat

  • Le f des pores (réticulation?)

  • La taille et la forme des particules

    • Petites

    • Sphériques

    • Granulométrie variable

  • L’inertie

  • L’affinité des gels pour les solutés

  • La consistance

classique

micomiètre 120 - micomiètre 40

micomiètre 80 - micomiètre 20

H performance

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Diff liaison érents supports

La phase stationnaire

Substrat du gel (phase dispersée)

La phase dispersante le solvant

Grains, bille ou perle

calibrées

différents polymères

dextrane

polyacrylamide

agarose

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Classification des gel d’exclusion liaison

Xérogels:

- mous

- semi rigides

Dextran ; agarose ; polyacrylamide;poly-; polyvinyl; styrènes

séphadex

Sepharose

BiogelA

ultrogel

Séphacryl

Biogel

ultrogel

Styragel

biobeads

fractogel

aérogels

rigides

Perles de verre

Ou silice poreuse

ne gonflent pas

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Colonnes de dessalages de solutions prot liaison éiques, prêtes à l'emploi, rapides et économiques.

En 3-4 minutes, les sels et molécules de poids moléculaire < 5 kDa sont éliminés

Caractéristiques du gel

􀂝 Polymère poreux hydrophile : réduction au maximum des adsorptions non spécifiques

􀂝 Stabilité mécanique élevée : résistance à des pressions jusqu’à 7 bars

􀂝 Stable aux pH de 0 à 14

􀂝 Pas de rétraction ni de dilatation des billes quel que soit le tampon

des colonnes TSK-Gel de chromatographie d’exclusion de tailles, aussi bien pour la GFC (Gel Filtration Chromatography) séparation de peptides, protéines et autres molécules solubles en milieux aqueux que pour la GPC (Gel Perméation

Chromatography) séparation de polymères solubles en milieux organiques.

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