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Presentation Transcript

    1. Proyecto Regional TCP/RLA/3107 Desarrollo de Bases de Datos y Tablas de Composición de Alimentos de Argentina, Chile y Paraguay para fortalecer el comercio internacional y la protección de los consumidores

    2. Contenido de Agua y Materia Grasa Prof. Lilia Masson Salaue lmasson@ciq.uchile.cl Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas , Centro de Investigación y Desarrollo en Grasas y Aceites, CIDGRA Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química,

    3. Métodos de determinación de agua en un alimento o bebida La determinación del porcentaje de agua en un alimento natural o procesado tiene diversas connotaciones: 1.- Es la base de referencia para calcular su aporte energético a partir de los porcentajes de macronutrientes: Proteínas Hidratos de carbono Materia grasa: AG Sat. Monoinsat. Poliinsat. ?6, ?3, AG.trans, colesterol

    4. Es la base del etiquetado nutricional en la expresión porcentual o por porción, no sólo de macronutrientes sino de: - Cenizas o contenido mineral - Fibra dietaria - Micronutrientes: minerales y vitaminas - Componentes bioactivos

    5. Información complementaria Contaminantes inorgánicos y orgánicos Componentes tóxicos naturales o generados en el procesamiento

    6. Importancia de su determinación Es la base de referencia para: Caracterizar un alimento Comparar alimentos en base seca o a un contenido de agua fija pre-determinada Realizar estudios de variaciones estacionales que se producen en diversos alimentos, como peces grasos, en que la relación agua, contenido graso es inversa, manteniéndose constante el contenido proteico Extracción de materia grasa en alimentos frescos

    7. Métodos de determinación de humedad Los métodos para determinar el contenido de agua en alimentos naturales y procesados se basan en la medida directa o indirecta del agua retirada de un alimento La medición de algunas propiedades físicas del alimento que cambian sistemáticamente con el contenido de agua

    8. La medición de la reactividad química del agua

    9. Métodos de secado Los métodos de secado son mas convenientes para alimentos que se están analizando con fines nutricionales La liofilización o secado por congelación ofrece la ventaja que el agua se retira bajo condiciones muy suaves El tejido deshidratado puede emplearse para la determinación de diversas sustancias y es fácil de homogeneizar

    10. El material liofilizado es liviano y fácil de transportar Desventaja: Los liofilizadores son caros El agua residual debe retirarse de la muestra liofilizada por presión reducida O sobre desecantes adecuados Esto añade una segunda etapa en el análisis

    11. El desecado de la muestra en estufa de vacío entre 60 – 70ºC es más eficiente, si una corriente de aire seco lenta se pasa a través del horno. Tiene la ventaja que las porciones analíticas pueden mantenerse por un tiempo (toda la noche) antes de su posterior tratamiento

    12. Requieren mínima intervención del personal del laboratorio Costos de capital bajos Este método es preferible al secado en estufa de aire forzado a 100-105ºC, un procedimiento ampliamente usado y de bajo costo

    13. Secado en aire a presión normal No es conveniente para muchos alimentos Especialmente los con alto contenido de azúcares que puede caramelizar Grasas que pueden sufrir oxidación o pérdida de materias volátiles como aceites o aceites esenciales

    14. Secado en microonda Ofrece la ventaja de la rapidez Requiere permanente vigilancia del personal del laboratorio para prevenir que la muestra se queme

    15. Método termovolumétrico Método de destilación por arrastre de vapor con tolueno o xilol de acuerdo a Dean y Stark Es aplicable a muchos alimentos y sobre todo a los que contienen cantidades significativas de compuestos volátiles diferentes al agua como las especias, que contienen aceites esenciales

    16. Método químico Karl Fisher. Tiene una exactitud mayor que la necesaria para un análisis nutricional de un alimento Es útil en alimentos de muy bajo contenido de agua, menos de 5 %, principalmente los higroscópicos.

    17. Métodos Instrumentales Se basan en una propiedad física del alimento Alta velocidad en la obtención de resultados Ej: NMR, NIR, Irefracción Se emplean en laboratorios que manejan un alto número de muestras de alimentos similares Tienen mayor aplicación en alimentos de humedad intermedia 5 - 20%. Requieren de una correcta calibración contra un material de referencia conocido patrón.

    18. ADVERTENCIA! Todos los métodos de secado liberan compuestos volátiles junto con el agua. Y deben hacerse correcciones por volátiles obvios como el etanol.

    19. Métodos para determinar Materia grasa Grasa Total La grasa de un alimento consiste de un número de diversos compuestos tanto unidos como libres. Encontrar un método que como una entidad única. mida la “ grasa total”, normalmente presenta bastante problemas

    20. Por lo tanto, hay diversos métodos disponibles y que se practican habitualmente en los laboratorios analíticos Los valores obtenidos por cada método para “ grasa total” dependen en gran medida del método empleado, especialmente en el caso de alimentos bajos en grasa.

    21. Métodos de extracción con solvente Soxhlet es de extracción discontinua Butt extracción continua Se debe trabajar sobre muestra seca en el laboratorio Tienen aplicación limitada, no son los mas recomendados, dado que en muchos alimentos naturales y especialmente los procesados la materia grasa se une a carbohidratos y proteínas

    22. Hay muchos tejidos que contienen cantidades importantes de fosfolípidos Gran consumo de tiempo Extracciones incompletas especialmente en cereales

    23. Las muestras están sometidas a altas tº por tiempos prolongados No es recomendable para materias grasas altamente poliinsaturadas Es método oficial para la extracción de aceite de semillas Variante Método Foss automático usa tetracloro etileno para extraer la rasa rápidamente Ha funcionado bien en productos cárneos

    24. Problemas adicionales Uso de solventes inflamables: Éter etílico, éter de petróleo, hexano Son solventes tóxicos Los valores del extracto graso no son los mismos si se usa eter etílico que es mas polar que hexano o éter de petróleo 40-60ºC que son menos polares CONLUSIÓN Empleo de Métodos alternativos

    25. Métodos Alternativos Empleo de mezcla de solventes polares y no polares Método de Bligh y Dyer y de Folch Ambos extraen los lípidos en forma más completa, pues extraen los fosfolípidos Dependiendo de la muestra a veces se requiere una purificación del extracto

    26. Aplicaciones: En nuestra experiencia cuando se va a estudiar o a investigar los lípidos del extracto, como composición en ácidos grasos, tocoferoles, fitosteroles, pigmentos carotenoides, clorofila, se recomienda aplicar estos Métodos. Para Alimentos aplicamos normalmente Bligh y Dyer Para fluidos biológicos: plasma. glóbulos rojos Folch

    27. Fundamento Cuando se tiene un alimento húmedo y se homogeniza con una mezcla de cloroformo metanol en determinadas proporciones, que son Cloroformo: Metanol : Agua 1:2:0.8 se forma entre los tres solvente un sistema miscible. Este sistema permite extraer los componentes lipídicos del tejido, sean triglicéridos, fosfolípidos, derivados lipídicos, etc. en su totalidad. Esta primera extracción exige que la matriz del alimento a extraer contenga 80% de humedad

    28. Para lo cual es requisito indispensable determinar previamente el contenido de agua del alimento y ajustar a 80% en caso necesario Una vez efectuada la primera homogeneización y extracción simultánea de la materia grasa del alimentos con la mezcla cloroformo, metanol, agua en la proporción señalada, se desestabiliza esta mezcla homogénea de solventes por adición de 1 parte adicional de cloroformo y 1 parte de agua, se llega a esta proporción: Cloroformo: Metanol: Agua = 2:2:1.8

    29. En esta proporción se desestabiliza la mezcla terciaria de los tres solventes y se separa la capa clorofórmica que disuelve los lípidos y la fase agua /metanol que no disuelve lípidos. Se descarta la capa metanol/ agua y los lípidos quedan en la capa clorofórmica

    30. Se mide el volumen de cloroformo en una probeta adecuada, se toma una alícuota, se evapora el cloroformo y se pesa el residuo para calcular el % de materia grasa. Otra alternativa es evaporar la totalidad el cloroformo en evaporador rotatorio empleando un matraz o balón tarado. Por diferencia de peso se obtiene el contenido graso extraído y se calcula el % de grasa de la muestra

    31. El Método de Folch que se basa en el mismo principio lo aplicamos para extraer los lípidos de fluídos biológicos como plasma, suero, o de elementos figurados como membrana de glóbulos rojos. En este caso los fluidos tienen del orden de 80% de humedad y no se requiere el ajuste

    32. En el caso de determinar contenido graso en alimentos que tienen los lípidos unidos a hidratos de carbono y/o proteínas, como es el caso de los alimentos procesados sometidos a altas tº como horneado, fritura, deshidratado, extruído, etc, nosotros aplicamos método de hidrólisis ácida. La muestra fresca homogeneizada se pesa, se trata con alcohol, se calienta en baño de agua entre 70-80ºC por 20 minutos para hidrolizar las uniones proteicas y de hidratos de carbono que tienen incluida la materia grasa y no hidrolizar la unión éster del ácido graso con el glicerol que constituye los triglicéridos

    33. Luego de la hidrólisis, el líquido se traslada a embudo de decantación o tubo de Mojonnier para proceder a la extracción de la materia grasa con éter etílico y éter de petróleo. Los extractos etéreos se separan por decantación, hay que tener cuidado con la formación de emulsiones. Los extractos etéreos se reciben en matraz tarado, se evapora el solvente en evaporador rotatorio y el residuo obtenido libre de solventes se pesa. Se controla peso constante por gaseado con Nitrógeno. Se calcula el % de grasa de la muestra

    34. APLICACIONES Nosotros lo aplicamos a todo tipo de alimentos: carnes, embutidos, queso, galletas, harinas, alimentos formulados, chocolate, alimentos fritos, horneados, extruídos, etc. Es un método universal, pero puede haber limitaciones en alimentos muy ricos en azúcar y en otros casos, una descomposición de fosfolípidos. Método Oficial de la AOAC para varios alimentos No lo aplicamos cuando se va a estudiar posteriormente los lípidos extraídos del alimento

    35. Método de Hidrólisis Alcalina Aplicación principal en Leche y derivados lácteos Fundamento: Los glóbulos de grasa están rodeados de una película de fosfolípidos que impide la extracción directa de la grasa con un solvente Esta capa de fosfolípidos se destruye con un álcali suave como es una solución de amoníaco diluída

    36. La muestra se transfiere a un embudo de decantación y se extrae de acuerdo al procedimiento con los solventes orgánicos. Los extractos se reciben en matraz tarado, se evapora el solvente en evaporador rotatorio y se controla peso constante por diferencia de pesada. Se calcula el % de materia grasa de la muestsra. Este método está aprobado internacionalmente AOAC, FIL, para leche derivados lácteos

    37. Métodos Instrumentales FT NIR Aplica la espectroscopia Infrarroja cercana para medir contenido graso en algunas matrices. Necesita calibración contra método oficial aplicado en la misma matriz. NMR Se ha desarrollado un método por NMR para medir contenido graso en semillas oleaginosas. Es muy rápido, requiere calibración con las respectivas semillas. Ambos son equipos de costo elevado

    51. DETERMINACIÓN DE ACIDOS GRASOS SATURADOS, MONOINSATURADOS, POLIINSATURADOS Y ACIDOS GRASOS TRANS Método Cromatografía Gaseosa (GC-FID)

    52. 1.0 OBJETIVO Determinar el perfil de los ácidos grasos, incluidos los isómeros trans en grasas y aceites de origen vegetal y animal. 2.0 CAMPO DE APLICACION El método está diseñado para evaluar el perfil de ácidos grasos en aceites y grasas vegetales y animales. 3.0 FUNDAMENTO Los ácidos grasos metilados de las muestras son separados y cuantificados por cromatografía gaseosa con detector FID en columna capilar de fase reversa. 4.0 REFERENCIAS ISO 15304 ”Animal and vegetable fats and oils – Determination of the content of trans fatty acid isomers of vegetable fats and oils – Gas chromatographic method.

    53. 5.0 TERMINOLOGÍA Acidos grasos trans: isómeros de configuración trans de todos aquellos ácidos grasos que contienen dobles enlaces. 6.0 MATERIALES INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Y EQUIPOS 6.1.1 Cromatógrafo de gases equipado con detector FID, muestreador automático e hidrógeno como gas carrier. 6.1.2 Balanza de precisión 0.001 g 6.1.3 Agitador mecánico de tubos 6.1.4 Micropipetas de 1000 µL 6.1.5 Viales con tapa de 2 mL para autosampler 6.1.6 Columna capilar DB-23 fase reversa, 60 m, 0.25 µm i.d., 0.25 mm de film. 6.1.7 Tubo de vidrio tapa rosca de 10 mL

    54. 6.2 REACTIVOS 6.2.1 Éter de petróleo p.a. 6.2.2 Solución de hidróxido de potasio en metanol 2 M 6.2.3 Estándar Supelco, mezcla de 37 ésteres metílicos de ácidos grasos. 7 DESARROLLO DEL PROCESO 7.1 Preparación de las muestras Antes de tomar la muestra, mezclar completamente. Fundir las muestras sólidas para asegurar una buena homogeneización, a no más de 60 °C. 7.2 Preparación de los ésteres metílicos: Pesar 250 mg de muestra en un tubo de vidrio con tapa rosca. Agregar 500 µL de hidróxido de potasio en metanol 2 M. Agregar 5 mL de éter de petróleo. Agitar 2 min en vortex, reposar 1 hora. Trasvasijar a los viales del muestreador automático . Inyectar.

    55. 7.3 Determinación 7.3.1 Condiciones cromatográficas T° detector: 250 °C T° inyector: 250 °C Programa de temperatura del horno: 120 °C por 5 min, aumentar la temperatura a razón de 10 °C/min hasta 180°C, mantener por 30 min. Aumentar nuevamente a razón de 10 °C/min hasta 210 °C y mantener por 21 min. (total 65 min). Flujo gas carrier: 15 psi Split: 1:100 Volumen de inyección: 1 µL 7.4 Expresión de resultados Para cuantificar los trans, hacer zoom en la zona de los C18, entre los 26 a 38 min. Considerar una altura de 33.000 a 55.000 µvolt.

    56. La fracción de masa relativa de cada ácido graso se calcula determinando el área corregida del peak correspondiente dividiéndola por la suma de las áreas de todos los peaks. Aceites y grasas refinadas a alta temperatura: Calcular los isómeros trans como la suma de las fracciones de masa relativa de los esteres metílicos de C18:1 trans, C18:2 trans y C18:3 trans, relativos a todos los ésteres metílicos de los acidos grasos. El maximo de peaks posibles de encontrar son C18:1 trans (1 peak), C18:2 trans (2 peak) y C18:3 trans (4 peak). Se expresa con 2 decimales. Aceites y grasas parcialmente hidrogenadas: Calcular los isómeros trans como la suma de todas las fracciones de masa relativa de todos los esteres metílicos de los ácidos grasos que contienen dobles enlaces con configuración trans, relativo a la suma de los esteres metílicos de todos los ácidos grasos. Se expresan con 1 decimal.

    57. OTRAS ALTERNATIVAS METODOLÓGICAS Determinación de ácidos grasos cis y trans en aceites y grasas hidrogenadas y refinadas por GLC capilar Método oficial AOCS Ce 1f-96. Emplea una fase líquida estacionaria altamente polar. Los ésteres metílicos de los ácidos grasos emergen de acuerdo a su largo de cadena (CL), grado de insaturación (UN), geometria y posición de los dobles enlaces (DB(s)).

    58. Fases líquidas recomend. y condic.de trabajo Fases líq: SP-2340 SP-2560 CP-SIL88 BPX70 Largo 60 m 50–100m 50-100m 50-120m t° C isoterm. 192 170 175 198 Puerta de inyección 250°C ; Detector FID 250°C Pr.de entrada(kPa) 125 125 130 155 Veloc. linear gas cm/seg 15 16 19 17 Split 1:100 Carrier : helio, nitrógeno, hidrógeno Estandard interno Tridecanoina 5mg/mL en CHCL3 Vol. Iny.: 0.5-1.0ul; concentración 7 mg/mL

    59. METILACIÓN Método BF3 de acuerdo a AOCS Ce 2-66 o IUPAC 2301. Muestras liquidas deben agitarse enérgicamente antes de su análisis Muestras sólidas deben fundirse antes de preparar los ME Siempre se trabaja sobre muestra de materia grasa anhidra

    60. Definición de AGT A) Para t° altas : aceites refinados y grasas: Suma ácidos grasos C18:1t;C18:2t;C18:3t B) Para aceites y grasas parcialmente hidrogenadas Suma de todos los AGT que contengan DB La suma obtenida por este método puede no dar el mismo valor obtenido por otros métodos.

    61. Cuantificación Si se requiere expresion en mg/g debe agregarse el estándar interno antes de la metilación y el cálculo se hace en base a concentración del estandar y área del acido graso . Si se está examinando una mezcla compleja para el contenido individual de ácidos grasos para fines de etiquetado, el estándar interno se agrega al tubo de ensayo antes de la extracción.

    62. Determinación del contenido de isómeros AGT en grasas y aceites vegetales. ISO15304:2002(E) Antecedentes: Durante la refinación (alta t°) desacidificación y desodorización,se forman sólo isómeros geométricos de los AG monoinsat y poliinsaturados, por lo tanto el doble enlace se mantiene en la misma posición, no hay migración caso oleico C18:9c y elaidico C18:9t Durante el proceso de hidrogenación se forman isomeros posicionales y trans

    72. Calculo del contenido de AGT Aceites y grasas refinadas a alta t° Suma de las fracciones de masa relativas de los C18:1 trans, C18:2trans y C18:3 trans, relativas a los ME totales. C18:1 t 1 pic, C12:2 trans 2 pics, y C18:3, 4 pics. Aceites y grasas parcialmente hidrogenadas Suma de los fracciones de masa relativas de todos los AGT FAME que tengan dobles enlaces trans, relativo a todos los FAME

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