人绒毛膜促性腺激素侧向层析检测试纸的研发
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人绒毛膜促性腺激素侧向层析检测试纸的研发. 学 院 :生命 科学 学院 专 业:生物工程 报 告 人:段海婷. 一、简介. 人绒毛膜促性腺激素(HCG)是孕卵着床后由人体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素 ,它是由α和β二聚体的糖蛋白组成,α亚基与垂体分泌的FSH(卵泡刺激素)、LH(黄体生成素)和TSH(促甲状腺激素)等基本相似,而β-HCG是HCG所特有的, HCG 的含量变化已成为检测是否妊娠的重要依据。 市面上销售的HCG试纸被大家所熟悉,然而它只适用于一般人群,本试纸灵敏度进一步提高,也可适用于不易检测的人群。. 二、检测原理.

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人绒毛膜促性腺激素侧向层析检测试纸的研发

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Presentation Transcript


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人绒毛膜促性腺激素侧向层析检测试纸的研发

学 院:生命科学学院

专 业:生物工程

报 告 人:段海婷


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一、简介

  • 人绒毛膜促性腺激素(HCG)是孕卵着床后由人体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素,它是由α和β二聚体的糖蛋白组成,α亚基与垂体分泌的FSH(卵泡刺激素)、LH(黄体生成素)和TSH(促甲状腺激素)等基本相似,而β-HCG是HCG所特有的,HCG的含量变化已成为检测是否妊娠的重要依据。

  • 市面上销售的HCG试纸被大家所熟悉,然而它只适用于一般人群,本试纸灵敏度进一步提高,也可适用于不易检测的人群。


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二、检测原理

以硝酸纤维素膜为载体,利用了微孔膜的毛细血管作用,滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移,通过抗原抗体结合,并利用金聚集呈现红色,检测抗原,检测结果一般有阴性和阳性。

试纸条主体示意图


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试纸条阳性示意图


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试纸条阴性示意图


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试纸材料的选择

金标抗体的制备

试纸条的测试

试纸条膜抗体的固定

试纸条的组装

金的选择

三、实验方法与结果


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1.金的选择

金在整个检测过程中起示踪的作用,其质量的好坏直接影响试纸的检测结果。

制备金一般使用的方法是用还原剂将氯金酸还原,制备金,其制备方法较多,本实验应用两种制备金的方法:柠檬酸钠法(水相)和硼氢化钠法(有机相)。


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柠檬酸钠法

柠檬酸钠法制备的金在1-100纳米之间,能均一稳定的分散在液体中,由一个基础金核和外面的双离子层构成,分散溶液中的H+ 构成金的最外层离子层,在金核表面紧连的是内层离子(AuCl2-),来维持金的悬液状态。


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硼氢化钠法

以硼氢化钠做还原剂,甲苯做溶剂,通过还原氯金酸制备得到金纳米粒子。这时金颗粒表面由十二硫醇做配位保护,巯基配位结合在金颗粒表面,碳链留在外面,此时的金纳米颗粒是疏水的。

两亲聚合物是既有疏水基团又有亲水基团的齿状聚合物,其通过疏水作用包裹在金纳米颗粒表面,从而使金纳米颗粒由有机相转移到水相。


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柠檬酸钠法制备金的表征

水相金溶液晶莹透亮,无混浊,色泽鲜艳,呈酒红色,

没有漂浮物。水相金粒径18.16nm,水相金最大吸收峰在520nm时吸收值是0.41。


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硼氢化钠法制备金的表征

上图的金成黑紫色,不浑浊,没有悬浮物,粒径为20.5nm,最大吸收峰在517nm时吸收值是0.19。


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两种制金方法的对比结果

上图蓝色线是水相金紫外可见分光光度检测结果,粉色线是有机相相金紫外可见分光光度检测结果。两种方法制备出来的金颗粒粒径基本一致,两种方法最大的不同就是柠檬酸钠还原法制备的金的吸收值Abs在最高峰及最高峰之前一直偏大,这说明,柠檬酸钠还原法制备的金浓度大,更适合本实验后面金标抗体的制备。


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2.金标抗体制备金标抗体即金和抗体大分子结合物,金在碱性条件下带负电荷,与蛋白质分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合,不会影响蛋白质活性。 左边的最大吸收峰在277nm处,是没有结合的抗体蛋白;右边的最大吸收峰在527nm,比原来的520nm大,说明金结合了抗体蛋白,体积变大。


3 a b c 37

3.试纸材料的选择把羊抗鼠二抗固定到A,B,C三种不同孔径的硝酸纤维素膜试纸同一位置处,将其37℃干燥后,在硝酸纤维素膜试纸的一端滴加金标抗体溶液,比较液体流速、是否会产生背景色,以及羊抗鼠二抗与金标抗体的结合效果。

B

C

A

B

C

B


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4.膜抗体的固定

膜的选择固定:固定蛋白用硝酸纤维素膜,因为此膜和蛋白质有很强的结合力;连接垫用玻璃纤维素膜,因为其有化学惰性,可以成为的金标物暂时载体,有利于金标抗体的释放。

金标抗体

抗体

羊抗鼠二抗


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5.试纸条的组装

试纸条由底板、样品垫 、连接垫 、 NC膜(检测线和质控线)和吸水纸组成。


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6.试纸条阳性、阴性结果测试

在试纸条一端分别滴加含有和不含人绒毛膜促性腺激素抗原的溶液,待5min后样品渗移到试纸的另一端,观察结果。

上图左侧是阴性结果图,右侧是阳性结果图,可以看出检测结果明显,而且两侧的三条试纸检测结果一样,体现了本试纸的重复性好,说明结果可靠,没有偶然性。


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试纸条灵敏度对比测试

将孕妇尿液稀释4倍,分别滴加于本实验的试纸和市面所卖试纸,待样品液渗移到试纸的另一端,观察结果。

上图是孕妇尿液稀释4倍后检测的结果对比图,左图是本实验制备试纸,右图是市面上所卖试纸,相同的检测原液不同的检测结果。可以看出本实验制备试纸质控线和检测线都明显一样红,而市面上所卖试纸检测线和质控线颜色深浅不一样,质控线颜色深一点,检测线只能看到淡淡的红色,由此可知本实验所制试纸比市面上的试纸灵敏度高。


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