Сравнительная геномика и метаболическая реконструкция бактериальных патогенов

1. Сравнительная геномика и метаболическая реконструкция бактериальных патогенов Михаил Гельфанд Институт проблем передачи информации РАН, Учебно-научный центр «Биоинформатика» XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»

2. Метаболическая реконструкция • Идентификация недостающих генов в полных геномах • Поиск кандидатов • Анализ генов с целью предсказания общей функции: • гомология • функциональные подписи • структурные особенности • Сравнительная геномика для предсказания специфичности: • анализ регуляции • позиционные кластеры • слияние генов • филогенетические паттерны

3. Как это работает: ферменты • Идентификация пробелов в метаболическом пути (универсальные, таксон-специфические, в отдельных геномах) • Поиск кандидатовна включение в путь:ко-локализация и ко-регуляция (во многих геномах) • Предсказание общей биохимической функциипо (далекому) сходству и функциональным подписям • Предварительное заполнение пробела • Верификация:анализфилогенетических паттернов: • отсутствие в геномах, не содержащих данного пути • дополнительное распределение с генами, имеющими ту же функцию

4. Как это работает: транспортёры • Поиск кандидатовна включение в путь:ко-локализация и ко-регуляция (во многих геномах) • Предсказание транспортной функции:анализтрансмембранных сегментовисходство • Предсказание специфичности:анализфилогенетических паттернов: • финальный продукт, если заменяет весь путь (встречается в геномах, не имеющих биосинтетического пути) • исходный продукт, если отсутствует в геномах, не содержащих пути (катаболические пути, предшественники в биосинтетических путях) • промежуточный продукт, если заменяет верхнюю или боковую часть пути

5. fabI(Enoyl-ACP reductase, EC 1.3.1.9),мишень триклозана. В стрептококках: есть ферментативная активность, ген не известен accA accD accB Пробел в пути биосинтеза жирных кислот у стрептококков GenefabI of Enoyl-ACP reductase (EC 1.3.1.9) is missing in the genome 12B, and a number of Streptococci accC fabD fabF fabH fabG fabZ fabI acpP

6. fabG fabF fabZ accC accD accA fabI 6.3.4.15 hyp acpP fabD accB hyp TR? 3.5.1.? fabH Genome X acpP fabH ? fabG fabF fabZ accC accD accA fabD accB TR? 2.1.1.79 FRNS Genome Y acpP fabG fabF fabZ accC accD accA fabH fabD accB ? TR? 5.99.1.2 Clostridium acetobutylicum acpP fabH ? TR? fabG fabF fabZ accC accD accA fabD accB hyp Streptococcus pyogenes Позиционные кластеры: идентификация гена-кандидата

7. Сайты связывания FabR (“Tr?”, HTH) Fad (42.1.17) HTH acpP fabH fabK fabG fabF fabZ accC accD accA fabD accB 1 2 3 4

8. Метаболическая реконструкция пути биосинтеза тиамина(новыегены/функции показаныкрасным) Purine pathway thiN(confirmed) Transport of HET Transport of HMP (Gram-positive bacteria) (Gram-negative bacteria)

9. Метаболизм сахаров у стрептококков и родственных бактерий биохимические данные, ген не известен эксперимен-тальныеданные биохимия + геномные предсказания только геномные предсказания

10. Неохарактеризованный путь у инвазивных видов S. pneumoniae S. pyogenes S. equi S. agalactiae S. suis

11. Структура локуса S. pyogenes, S. agalactiae S. equi S. pneumoniae TIGR4 S. pneumoniae R6 S. suis

12. hyaluronidase(hyaluronate lyase) RegR Функции генов 3-(4-deoxy-beta-D-gluc-4-enuronosyl)-N-acetyl-D-glucosamine PTS transporter hydrolase isomerase oxidoreductase dehydrogenase kinase aldolase pyruvate + D-glyceraldehyde 3-phosphate

13. Потенциальный регуляторный сигнал

14. Структура локуса - 2 S. pyogenes, S. agalactiae S. equi S. pneumoniae TIGR4 S. pneumoniae R6 S. suis

15. Возможная функция • Путь имеется у инвазивных видов • Иногда ко-локализован с геном гиалуронидазы • Всегда ко-регуляруется с геном гиалуронидазы Вывод: • Функция – утилизация гиалуроновой кислоты • Возможно, вовлечен в патогенез

16. Сравнительная геномика цинковых регулонов Две основных роли цинка у бактерий: • Структурная: ДНК-полимеразы, праймазы, рибосомные белки и т.д. • Каталитическая: протеазы и другие ферменты

17. Геномы и регуляторы nZURFUR family ??? pZURFUR family AdcR ?MarR family

18. nZUR- nZUR- Регуляторы и сигналы GAAATGTTATANTATAACATTTC GATATGTTATAACATATC GTAATGTAATAACATTAC TTAACYRGTTAA pZUR AdcR TAAATCGTAATNATTACGATTTA

19. Транспортеры • Ортологи известных систем AdcABC и YciC • Паралоги отдельных компонентов систем AdcABC и YciC • Потенциальные транспортеры с неохарактеризованной специфичностью

20. zinT: регуляция zinT is regulated by zinc repressors (nZUR-, nZUR-, pZUR) zinTis isolated E. coli, S. typhi, K. pneumoniae Gamma-proteobacteria A. tumefaciens, R. sphaeroides Alpha-proteobacteria B. subtilis, S. aureus S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes, L. lactis, E. faecalis Bacillus group Streptococcus group adcA-zinT is regulated by zinc repressors (pZUR, AdcR) (ex. L.l.) fusion:adcA-zinT

21. ZinT: анализ белковой последовательности TM Zn AdcA Y. pestis, V. cholerae, B. halodurans ZinT S. aureus, E. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes E. coli, S. typhi, K. pneumoniae, A. tumefaciens, R. sphaeroides, B. subtilis L. lactis

22. ZinT: сводка • zinTиногда слит с геном компоненты цинкового транспортёра adcA • zinTэкспрессируется только при недостатке цинка • ZinT находится на поверхности клетки (имеет трансмембранный сегмент) • ZinT имеет цинк-связывающий домен ZinT: вывод • ZinT – это новый тип цинк-связывающей компоненты цинкового ABC-транспортёра

23. lmb phtD zinc regulation shown in experiment Цинковая регуляция генов, кодирующих PHT-белки (pneumococcal histidine triad) у стрептококков S. pneumoniae S. pyogenes S. equi S. agalactiae phtE lmb phtD lmb phtD phtA phtB phtY

24. Структурные особенности PHТ-белков • PHT-белки содержат множественные мотивыHxxHxH • PHT-белкиS. pneumoniae-паралоги (65-95% тождество) • Sec-зависимаягидрофобная лидерная последовательнстьна N-концах • Локализация PHT-белковS. pneumoniaeна поверхности бактериальной клеткибыла показана экспериментально

25. PHТ-белки: сводка • PHT-белки экспрессируются при недостатке цинка • PHT-белки локализованы на поверхности клетки • PHT-белки имеют цинк-связывающие мотивы Гипотеза: • PHT-белки – это новый класс бактериальных транспортёров цинка

26. Цинк-связывающие домены в транспортёрах цинка: EEEHEEHDHGEHEHSH HSHEEHGHEEDDHDHSH EEHGHEEDDHHHHHDED DEHGEGHEEEHGHEH (гистидин-аспартат-глютамат) Гистидиновые триады у стрептококков: HGDHYHY 7 out of 21 HGDHYHF 2 out of 21 HGNHYHF 2 out of 21 HYDHYHN 2 out of 21 HMTHSHW 2 out of 21 (специфический паттерн гистидинов и ароматических аминокислот) … неверно

27. HDYNHNHTYEDEEGH AHEHRDKDDHDHEHED LRR IR PHT internalin H-rich Анализ PHТ-белков (продолжение) • ГенphtDводит в один оперон с геномlmbво всех геномах стрептококков • Lmb: адгезин, участвующий в связывании ламинина и вторжении стрептококков в эпителиальные клетки • PhtY изS. pyogenes: • phtYрегулируется AdcR • PhtY состоит из трёх доменов: 4 HIS TRIADS

28. PHТ-белки: сводка-2 • PHT-белкииндуцируются недостатком цинка • PHT-белкилокализованы на поверхности клетки • PHT-белкиимеютструктурные цинк-связывающие мотивы • phtDобразует оперон с геном адгезина • PhtY содержитдомен интерналина,отвечающие за инвазию стрептококков Гипотеза PHT-белки – этоадгезины,участвующие в прикреплении стрептококков к эпителиальным клеткам , что приводит к инвазии

29. цинк и паралоги рибосомных белков nZUR pZUR AdcR

30. Мотив «цинковая лента»(Makarova-Ponomarev-Koonin, 2001) nZUR pZUR AdcR

31. Сводка наблюдений: • Makarova-Ponomarev-Koonin, 2001: • L36, L33, L31, S14 – единственные белки, имеющие паралогов в нескольких видах • L36, L33, L31, S14 – это четыре из семи белков, имеющих мотив «цинковая лента» (четыре цистеина) • Одна из двух(или более)копий белков L36, L33, L31, S14 обычно содержит мотив «цинковая лента», а остальные – нет • Среди генов, кодирующих паралоги рибосомных белков, (почти) всегда один ргулируется цинковым репрессором, а кодируемый им белок никогда не содержит «цинковой ленты»

32. недостаточно цинка: весь цинк использован рибосомами, не хватает цинка для ферментов Плохой сценарий достаточно цинка

33. Регуляторный механизм Sufficient Zn ribosomes R repressor Zn-dependentenzymes Zn starvation R

34. недостаточно цинка: некоторые рибосомы содержат паралоги без цинка, остаётся цинк для ферментов Хороший сценарий достаточно цинка

35. Предсказание …(Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Aug 19;100(17):9912-7.) … и подтверждение(Mol Microbiol. 2004 Apr;52(1):273-83.)

36. Андрей Миронов Анна Герасимова Ольга Калинина Алексей Казаков(гиалуронат) Екатерина Котельникова Галина Ковалёва Павел Новичков Ольга Лайкова(гиалуронат) Екатерина Панина(цинк)(сейчас в UCLA, USA) Елизавета Пермина Дмитрий Равчеев А.Б.Рахманинова Дмитрий Родионов (тиамин) Алексей Витрещак(тиамин)(сейчас LORIA, France) Howard Hughes Medical Institute Ludwig Institute of Cancer Research РФФИ РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология») • Андрей Остерман(Burnham Institute, San-Diego, USA)(жирные кислоты)