Aktivacija onkogena

1. Aktivacija onkogena

2. Mehanizmi aktivacije onkogena • Uloga onkogena u normalnim stanicama: kontrola staničnog ciklusa, neki djeluju kao faktori rasta, signalni transduktori iz citoplazme u jezgru, aktivatori transkripcije ili replikacije. Neki onkogeni potiču metastaziranje. • Ako se fragmenti DNA tumorske stanice ubace u normalnu stanicu nastaje transfekcija. Normalne stanice budu transformirane nerijetko i aktivacijom staničnih onkogena.

4. Mehanizmi aktivacije onkogena • Onkogeni mogu blokirati staničnu diferencijaciju. Prekomjerna ekspresija MDM2 regulatora staničnog ciklusa događa se u približno 30% sarkoma. To inhibira Myo-D i p53 i tako blokira diferencijaciju mišićnih stanica i inducira aneuploidiju. Prekomjerna produkcija MDM2 proteina čini ga onkoproteiom. • U sarkomima se može vidjeti i kromosom 3q, kojim nastaje duplikacija ART (ataxia teleangiectasia i rad 3) gena koji također blokira p53 i MyoD funkciju.

5. Mehanizmi aktivacije onkogena • Akutna mijeloična leukemija povezuje se sa t(15/17) kojom se fuzira receptor retinoične kiseline  (RARA) gena sa premijeloičnim leukemija lokusom (PML). • Neki onkogeni potiču karcinogenezu odgađajući apoptozu. Translokacije t(14/18)(q32/q21) zastupljene u 85% folikularnih limfoma fuziraju BCL2 gen na 18q21 sa lokusom za aktivne imunoglobulinske teške lance i dovode do hiperprodukcije BCL2 genskog produkta, proteina unutarnje membrane mitohondrija koji blokira apoptozu prevenrajući stvaranje reaktivnih kisika. • Neki onkogeni proteini kao što su Myb i Ras induciraju ekspresiju BCL2. Potrebna je još jedna promjena za malignu transformaciju a to je obično aktivacija Myc.

6. Mehanizmi aktivacije onkogena • Protein koji nastaje fuzijom BCR-ALB inhibira apoptozu omogučavajući drugim onkogenim proteinima djelovanje na stanice i produkciju stanica kronične mijeloične leukemije (CML) i akutne limfatičke leukemije (ALL).

7. Recipročna translokacija i aktivacija onkogena • MYC onkogen se aktivira translokacijom u većini malignih Burkitt-ovih limfoma. Većinom i malignim stanicama ovakvih bolesnika nalazimo t(8;14) (q24;q32.3). • MYC gen je smješten na 8q24, a imunoglobinski teški lanci (IgH) na 14q32.3. Nova lokacija MYC gen smješta uz promotor prekinutog IgH gena i mijenja njegovu ekspresiju u limfoidnim stanicama. • U manjem broju slučajeva 8q se translocira na 2p11 ili na 2q11 smještajući MYC gen uz promotor gena za Ig kapa ili lambda lake lance. MYC onkogen se opet na isti način aktivira u limfomima.

9. Recipročna translokacija i aktivacija onkogena • Prva opisana kromosomska aberacija bila je Philadelphia kromosom opisan 1960. godine u CML. Radi se o recipročnoj translokaciji između 9q i 22q kromosoma. Molekularnim citogenetičkim tehnikama pokazano je da translokacija aktivira onkogen ALB sa 9q34.1 premještajući ga pod aktivaciju promotoru BRC (breakpoint cluster regon) gena na 22q11.2 koji ima jaku ekspresiju u limfocitima. Rezultat je novi fuzirani gen.

10. Recipročna translokacija i aktivacija onkogena • Ako se pucanje kromosoma dogodi u intronima dva gena ne mijenja se kodirajuća sekvenca egzona pa se proizvodi funkcionalni fuzirani protein. • Čak i kada su točke pucanja u istoj pruzi citološki gledano, one mogu biti na različitoj molekularnoj lokaciji. • To objašnjava činjenicu da neke t(9;22) (q34;q11) dovode do CML a neke do akutne limfoblastične leukemije (ALL). Naime BCR-ALB fuzirani protein od 210kDa dovodi do CML, a onaj od 190kDa do ALL.

11. Kako translokacija aktivira stanične onkogene • Dva su mehanizma kojima se translokacijom aktiviraju onkogeni. • Prvi je premještanje protoonkogena pod kontrolu jakog aktivnog promotora (MYC gen). U leukemijama, limfomima i mijelomima jedna točka pucanja je obično u IgH, Ig kapa, Ig lambda ili T-stanični receptor gen.

13. Kako translokacija aktivria stanične onkogene • Mnoge translokacije specifičnih limfoidnih malignoma i solidnih tumora ne uključuje Ig ili T-stanične receptor gene. Precizni molekularni način nije objašnjen za većinu od njih. • BCR-ALB translokacija prisutna u CLL događa se u 5kb velikoj BCR regiji rekombnacijom koja uključuje ponavljajuće sekvence. BCR-ALB fuzija gena je najbolje objašnjena, ali postoji još čitav niz koji nije objašnjen

15. Amplifikacija i onkogenska aktivacija • Amplifikacija je važan mehanizam karcinogeneze. Onkogeni se često aktiviraju amplifikacijom. Homogeno obojane regije (enl. homogeneously stained region, HSRs) i “double minutes” (DMs) primijećeni su u mnogim primarnim tumorima i kulturama malignih stanica. U karcinomima kolona HSRs i DMs uzrokuju amplifikaciju MYC gena. • Gen koji regulira stanični ciklus, ciklin D1, na 11q13 kromosomu amplificiran je u mnogim tipovima tumora – Ca ezofagusa na koje utječu faktori okoline, alkohol, duhan i uzimanje nitrozamina.

17. Amplifikacija i onkogenska aktivacija • Tumorski promotori također mogu djelovati potičući gensku amplifikaciju. Ciklin D2, folikul stimulirajući hormon (FSH), geni uključeni u proliferaciju gonadalnih stanica amplificiraju se u mnogim ovarijskim i testikularnim tumorima. • Gen za kinazu 6 ovisnu o ciklinima (CDK6) amplificira se do 50 puta u gliomima. U gliomima se amplificiraju multipli geni na 12 kromosomu. Jedan je CDK4 drugi MDM2 koji su regulatori staničnog ciklusa. MDM2 protein veže se na retinoblastomski i p53 gen.

18. Relaksacija imprintinga i onkogena aktivacija • U mnogim tumorima primjećena je hipometilacija gena. Kada to uključuje “imprintirane” gene imprint se gubi, a pojačava se ekspresija gena dovodeći do povećanja genskih produkata. Takvi geni mogu funkcionirati kao onkogeni. H19 i IGF2 (engl. insulin-like growth factor) geni su impritirani koji pokazuju monoalelnu ekspresiju očevih alela. Gubitak impintinga ovih gena primjećen je u tumorima pluća, bubrega, grlića maternice, ovarija, testisa i želuca. Obično se vidi u benignih tumora što ukazuje na postepenu tumorogenezu.

19. Inaktivacija tumor supresor gena

20. Prvi dokazi o tumor supresor genima • 1969. godine pokazano je da fuzijom normalnih i malignih stanica nastaju nemaligne hibridne stanice. Rijetko hibridne stanice mogu rasti kao maligni subklonovi. Oni uvijek pokazuju gubitak kromosoma koji potječu od normalnih roditelja, što ukazuje na to da jedan ili više tih kromosoma nose tumor supresor gen. Ovo je potvrđeno studijama koje pokazuju da dodatak tog kromosoma, dijela kromosoma ili jednog gena suprimira tumorski rast.

21. Prvi dokazi o tumor supresor genima • Funkcija tumor supresor gena je prevencija neregularnog rasta stanica. Kada su izbrisane, mutirane ili inaktivirane obje kopije ovog gena nedostatak njihovih proteina omogućava nekontroliran rast. • Individue koje imaju nasljedno mutaciju jednog od tumor supresor gena imaju znatno veći rizik oboljevanja od jednog ili više tipova tumora.

22. Gubitak alela i gubitak heterozigotnosti • Gubitak segmenta kromosoma koji nosi divlji alel u heterozigotnoj stanici vodi gubitku tumor supresorskog produkta. • Gubitak heterozigotnosti (engl. loss of heterozygosity, LOH) se događa 10-100 puta češće nego točkaste mutacije. • Ona je odgovorna za 80% familijarnih tumora dojke i ovarija.

23. Retioblastom (RB) • Dječji retinoblastom je najviše istraživan tumor uzrokovan inaktivacijom tumor supresor genima. • RB se može pojaviti kao izolirani tumor, obično zahvaćajući samo jedno oko. Može biti nasljedan, u tom slučaju su tumori multipli, zahvaćaju oba oka. • Genotip osobe s nasljednim RB je RB/rb ili RB/-, gdje rb predstavlja nefunkcionalni alel, dok – znači deleciju lokusa. Somatska mutacija ili delecija preostalog zdravog aela je potrebna da bi došlo do maligne transformacije stanica retine.

24. Retioblastom (RB) • U osoba sa genotipom RB/rb ili RB/- rizik razvoja RB je oko 100 000 puta više nego u općoj populaciji kao i rizik od drugih tipova tumora posebno osteosarkoma. • Mnogi tipovi tumora povezani su s inaktivacijom gena, nazvanim RB1, ili njegovim proteinom pRB. • Mnogi tipovi tumora pokazuju genetičku alteraciju proteina koji raguliraju pRB kao što su ciklin D, CDK4, ili p16 inhibitor staničnog ciklusa. • U preko 90% karcinoma grlića maternice, RB protein je inaktiviran vezanjem E7 proteina humanog papiloma virusa.

25. Mehanizmi tumorske supresije funkcionalnim RB1 genom • pRB djeluje kao negativan regulator rasta i supresor tumora na dva načina: 1. Veže se za transkripcijski faktor RNA polimeraze 1 i inhibira ribosomalnu RNA transkripciju. 2. Značajnije, pRB zaustavlja staničnu proliferaciju u sredini G1 faze staničnog ciklusa vežući se za E2F transkripcijski faktor koji je važan za prelazak iz G1 u S fazu staničnog ciklusa i DNA replikaciju. • Nedostatak RB1 gena dovodi do nekontrolirane stanične proliferacije.

26. P53 tumor supresor gen, TP53 • Mnogi su tumor supresor geni uključeni u kontrolu normalnog staničnog ciklusa i proliferaciju:

27. P53 tumor supresor gen, TP53 • Mutacija TP53 je vrlo učestala u tumorima. Protein gena p53 ja neophodan u G1 kontrolnoj točki koji zaustavlja stanice sa oštećenom DNA u G1 fazi staničnog ciklusa dok se DNA ne popravi. Protein gena p53 je također neophodan za apoptozu kojom se uništavaju stanice koje ne mogu popraviti svoju DNA. Ako stanice uđu u S fazu s oštećenom DNA one će dati stanice kćeri sa mutacijama i lomovima kromosoma. Izostanak apoptoze omogućava progresivno slaganje većeg broja mutacija čime mogu nastati još malignije stanice. U mnogim tumorima mutirani su RB1 i p53.

28. Drugi geni koji utječu na stanični ciklus • Gubitak kromosoma, LOH ili submikroskopske delecije mogu dovesti do gubitka aktivnosti ovih gena. • Inhibitori kinaza ovisnim o ciklinima (CDK) zaustavljaju stanični ciklus i na taj način kontroliraju proliferaciju stanica. Tumor-supresorska funkcija pRB i p53 je također izbjegnuta mutacijom ARF1/NK4a (CDKN2A) genskog lokusa 9p21. One su gotovo jednako česte kao i mutacija samog TP53. Jedan lokus daje dva različita genska produkta, p16/INK4A i p19/ARF koristeći dva različita promotora i dvije različite sheme čitanja što daje dva različita proteina.

29. Drugi geni koji utječu na stanični ciklus • Protein p16 gena inhibira CDK4 i CDK6 i tako blokira fosforilaciju RB proteina zadržavajući ga u fazi supresije rasta. Protein p19 smješten je u jezgrici ali je napušta kada se protein MDM2 veže za p53 i formira kompleks s njim. Ovo blokira izlazak p53 iz jezgre i njegovu degradaciju. Mutacija CDKN2A dovodi do smanjenja pRB i p53. Mnogi tumori pokazuju deleciju obje kopije CDKN2A gena.

31. Drugi geni koji utječu na stanični ciklus • Mutacija BRCA1 gena pronađena je u većini obitelji sa tumorima dojke i ovarija zajedno. Ovaj gen ponaša se kao tumor supresor gen aktivacijom WAF1/C1P1 proteina, produktom gena p21 koji blokira stanični ciklus u S fazi. • BRCA je također neophodan kod oštećenja DNA oksidacijom.

32. “Imprinting” tumor supresor gena • Imprintirani genski lousi su oni u kojima je majčin ili očev alel inaktiviran metilacijom 5’ promotora CpG otoka. Stanice tako zadržavaju jednu funkcionalnu kopiju impritiranog gena, a jedna mutacija je dovoljna da poništi ovu funkciju za razliku od drugih normalnih gena gdje su potrebne dvije neovisne mutacije da se izgubi funkcija gena.

33. “Imprinting” tumor supresor gena • Tumori dojke su najčešći tumori. Vjerojatno jedan od razloga može biti taj što je tumor supresor gen ovog tumora HIC1 (hiermethylated in cancer 1) imprintiran u kanalićima mliječne žlijezde sa jednim hipermetiliranim alelom. • Drugi imprintirani tumor supresor gen je H19. Njegova RNA se ne prevodi u protein nego sama ima tumor supresorsku aktivnost. • Kod Wilmsovog tumora, dječjeg tumora bubrega gubi se aktivnost impritiranog majčinoga KIP2 gena na 11 kromosomu. Njegov protein p57 inhibitor je G1 kinaze ovisne o ciklinima.

34. Geni koji suprimiraju onkogene ili utječu na transkripciju • Karcinom kolona često prekomjerno prepisuje RNA sa MYC gena čime nastaje veća količina proteina međutim to nije uzrokovano amplifikacijom ni promjenama gena. • MYC funkcionira samo kao heterodimer sa MAX proteinom. 4 su proteina MAD/MXI1 obitelji u kompeticiji sa MYC proteinom u vezanju za MAX i tako se blokira aktivnost MYC. Geni za četiri MAD/MXI1 proteina smješteni su na lokusima koji su često promijenjeni u tumorskim stanicama.

35. Geni koji suprimiraju onkogene ili utječu na transkripciju • Delecija na kromosomu 10q23 čest je kod endometrijskog karcinoma, karcinoma prostate, dojke i u glioblastomima. Delecija dovodi do gubitka tumor supresor gena PTEN. PTEN protein je fosfataza koja djeluje na fosfatidilinozitol 3,4,5 trifosfat (PIP3) ključna komponenta kontrole rasta koja stimulira proliferaciju a suprimira apoptozu. • PTEN protein sekvencionalnu sličnost sa citoskeletnim proteinom tenzinom koji se veže za aktinske filamente. • Prekomjerna ekspresija PTEN inhibira staničnu migraciju, širenje, fokalnu adheziju, što ukazuje da bi on mogao djelovati kao tumor supresor gen negativnom interakcijom stanične interakcije sa ekstracelularnim matriksom.

37. Geni koji utječu na staničnu adheziju • Većina normalnih stanica se obavezno treba učvrstiti, vezati za ekstracelularni supstrat da bi se podijelila.Razlog za to je aktivacija ciklina E/CDK2 kinaze u kasnoj G1 fazi koja započinje prelazak iz G1/S fazu. Kinaza je uvijek aktivna u tumorskim stanicama koje ne ovise o učvršćivanju. Ovo može značiti da normalne stanice proizvode supresor ciklina E osim ako su učvršćene za ekstracelularni matriks i da kada inaktivacija ili delecija utišava supresor, stanice se mogu podijeliti i kada nisu učvršćene.

38. Geni koji utječu na staničnu adheziju • Nekoliko gena za kadherin u tumorskim stanicama pokazuju LOH. • E-kadherin je adhezijska molekula epitela koja uglavnom nedostaje u agresivnih epitelnih tumora. Ako se ponovno uspostavi ekspresija E-kadherina suprimira se tumorska invazivnost. • APC (kod polipa debelog crijeva) može djelovati kao tumor supresor gen na dva načina: 1. APC se veže za -katenin i degradira ga, što blokira aktivaciju Tcf4 transkripcijskog faktora kojeg -katenin aktivira. 2. APC također interferira sa EB1 proteinom mikrotubula. • Gubitak APC funkcije rezultira nekontroliranom aktivacijom -katenin /Tcf4gena.

39. Geni koji utječu na staničnu adheziju • Von Hippel-Lindau (VHL) sindrom je rijetki autosomalno dominantni tumor bubrega, gušterače i mozga. • VHL protein neophodan je za formiranje ekstracelularnog matriksa. U tumorskim stanicama može se vidjeti delecija ili točkasta mutacija ovog gena.

40. Geni koji suprimiraju metastaziranje • Transfekcija KISS cDNA u tumorske stanice suprimira metstaziranje. • Izgleda da kromosom 6 nosi različite gene koji suprimiraju metastaziranje čija je ekspresija neophodna za ekspresiju KISS1 koji je smješten na 1q32-q41. • DAP kinaza utječe na apoptozu. Neki tumori pluća koji metastaziraju pokazuju smanjeni nivo DAP kinaze. • Kada se tumorskim stanicama doda funkcionalni DAP gen smanjuje se njihovo metastaziranje i povećava apoptoza.