1 / 15

Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése

Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése. Az eukarióta gének csoportjai. I. - 5.8S, 18S, 28S rRNS III. - 5S rRNS, tRNS II. - fehérjék. POLII. TIP120. TFIIF. TATA. A transzkripciós iniciációs komplex kialakulása. TFIIE. TFIIH. TFIIB. TFIIA. TBP.

karyn-bowman
Download Presentation

Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése

  2. Az eukarióta gének csoportjai • I.-5.8S, 18S, 28S rRNS • III.-5S rRNS, tRNS • II.-fehérjék

  3. POLII TIP120 TFIIF TATA A transzkripciós iniciációs komplex kialakulása TFIIE TFIIH TFIIB TFIIA TBP

  4. A TIP120 fehérje néhány jellemzője • 1230 AS, szimpla polipeptid • Affinitást mutat a TBP-vel és az RNS Pol II Rpb5 alegységével • Az iniciációs komplex összeszerelődését serkenti • A funkció betöltésében fontos a molekula N-terminális 1/3-a • A TIP120 fehérjét kódoló gént kimutatták patkányban, Coenorhabditisban, Drosophilában, emberben, Arabidopsisban

  5. T-DNS LB RB Növényi gén promóter 5' UTR exon/intron 3' UTR Funkcióvesztéses mutáció Inszerciós mutagenezis T-DNS inszerció

  6. A H911 vonalban azonosított mutáns Columbia: normál fenotípus H911/4: apró fenotípus

  7. A H911 mutáns virágja H911/4: Majdnem teljesen steril Columbia: Normál fenotípus

  8. T-DNS inszerció pozíciója a H911 vonalban R L 2. Krom., BAC T8K22 T-DNS inszerció: 13. exon (3301bp) Gén: At2g02560 Protein: feltételezett TBP kölcsönható fehérje (120 kD) (TBP Interacting Protein, TIP120)

  9. Az Arabidopsistip120 gén Lokalizáció: 2. kromoszóma, AT2G02560 jelű lókusz Exon-intron szerkezet: 28 exon

  10. T-DNS LB primer 5’ H911A H911B 3’ Alvonal: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fenotípus: n n n n n n n n a a Genotípus: +/+ +/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/+ -/- -/- 1500bp 1000bp 750bp 800bp, H911A+H911B 1500bp 1000bp 750bp 600bp, LB1+H911B PCR analízis eredménye A H911 vonal szegregációs analízise PCR primerekvad típus heterozigóta homozigóta H911A+B + + - H911B+LB - + +

  11. A tip120 gén expressziójának vizsgálata 1. Northern analízis: vad típusú Arabidopsis, illetve apró fenotípusú mutáns totál RNS felhasználásával: nincs detektálható jel. 2. Realtime RT-PCR analízis: tip120 CT értéke: 20.97 actin kontrol CT értéke: 15.61 tip120 gén expressziós szintje 32x alacsonyabb az actin gén expressziós szintjénél.

  12. A TIP120 fehérjét kódoló teljes hosszúságú cDNS klónozása TIP1 TIP2 ATG STOP PCR-amplifikálás (ELONGASE enzim, Invitrogen) BamHI- klónozás pBLUESCRIPT vektorba cDNS- klón: 3990 bp A cDNS szekvenálásának stratégiája TIP5 TIP6 TIP2 TIP3 TIP1 H911A TIP4 BamHI pBS SK+

  13. A tip120 cDNS-klón vázlatos térképe 3’ 5’ EcoRI BamHI BamHI SacI T17 EST T17 ATG STOP A tip120 cDNS további klónozása: pAS2 kéthibrid vektor pPCVB1 expressziós vektor

  14. Összefoglalás • - a H911 mutáns előállítása T-DNS inszerciós mutagenezissel • - az apró fenotípust a tip120 génben bekövetkezett homozigóta inszerció • okozza • - a tip120 expressziója alacsony szintű • a tip120 cDNS klónozása pBS, pPCVB1 növényi expressziós vektorba • élesztő-kéthibrid rendszer kidolgozása folyamatban van

  15. Köszönetnyilvánítás -Dr. Szabados László -Dr. Kovács Izabella -Dr. Martha Alvarado -Dr. Ökrész László -Zsigmond Laura -Ábrahám Edit -Bíró Anikó -Dr. Maróy Péter -Dr. Boros Imre

More Related