Augu un dzīvnieku audu fiksācija 1. laboratorijas darbs izpildes laiks – 3 astronomiskās stundas

1. Augu un dzīvnieku audu fiksācija1. laboratorijas darbsizpildes laiks – 3 astronomiskās stundas Šūnu bioloģijas metodes Tūrs Selga

2. Šūnu bioloģijas metodes • Šūnu audzēšanas metodes; • Funkcionālās metodes; • Molekulārās metodes; • Mikroskopiskās metodes.

3. Šūnu audzēšanas metodes • Augu meristēmu kultūras; • Augu šūnu kultūras; • Dzīvnieku audu kultūras; • Dzīvnieku šūnu kultūras.

4. Šūnu audzēšanas metodesAugu šūnu kultūras Piemērs kultūras iegūšanas un izmantošanas tehnoloģijai: • Sasmalcina auga lapas; • Ievieto tās pektināzē (enzīms, kas noārda šūnu sieniņas); • Ievieto minerālvielu barotnē (šķīdumā) (Murshige and Skoog); • Šajā etapā vai arī nākamajā etapā šūnās var ievietot arī svešu DNS; • Maina hormonālo sastāvu un iegūst kalusu; • Mainot barotnes sastāvu panāk atsevišķu kalusa daļu diferencēšanos par saknēm un stumbru.

5. Mikroskopijas metodes • Preparātu sagatavošana (fiksācija, krāsošana, griešana); • Histoķīmija (Šifa reaģents, DAPI); • Antivielas (antiviela un koloīdais zelts); • Vitālā krāsošana (Janus zaļais); • Ģenētiski modificētas šūna, kas satur zaļo fluorescento olbaltumvielu; • Gaismas mikroskopija; • Fluorescences mikroskopija; • Video mikroskopija; • Konfokālā mikroskopija; • Transmisijas elektronu mikroskopija; • Skenējošā elektronu mikroskopija.

6. Mikroskopijas metodes • Preparātu sagatavošana (fiksācija, krāsošana, griešana); • Histoķīmija (Šifa reaģents, DAPI); • Antivielas (antiviela un koloīdais zelts); • Vitālā krāsošana (Janus zaļais); • Ģenētiski modificētas šūna, kas satur zaļo fluorescento olbaltumvielu; • Gaismas mikroskopija; • Fluoresceces mikroskopija; • Video mikroskopija; • Konfokālā mikroskopija; • Transmisijas elektronu mikroskopija; • Skanējošā elektronu mikroskopija.

7. Mikroskopisko preparātu pagatavošanas metodes • Fiksācija; • Griešana; • Krāsošana; • Novietošana uz priekšmetstikliņa; • Pagaidu un pastāvīgie preparāti; • Atūdeņošana; • Preparāta ieslēgšana.

8. Pagatavojamie preparāti 1.Gaismas mikroskopija • 1.1. Augu spiestie preparāti • 1.2. Augu grieztie preparāti- a) pagaidu, b) pastāvīgie • 1.3. Dzīvnieku grieztie preparati - a) pagaidu, b) pastāvīgie • 1.4. Augu šūnu izolēšana un kultivēšana • 1.5. Dzīvnieku šūnu izolēšana un kultivēšana 2. Luminiscences mikroskopija • 2.1. Autoluminiscence in vivo • 2.2. Paraugu krāsošana in vivo • 2.3. Paraugu fiksācija un krāsošana 3. SEM • 3.1. Neapputināti paraugi – a) augi, b)dzīvnieki, c) raugi • 3.2. Apputināti paraugi – a) zelta un platīna, b) grafīta 4. TEM • 4.1. Parauga fiksācija, atūdeņošana ieslēgšana eponā • 4.2. Piramīdas un sietiņu sagatavošana • 4.3. Parauga kvalitātes novērtēšana un paraugu analīze

9. Fiksācijai izmantojamie paraugi

10. Fiksācijai izmantojamie trauki un instrumenti.

11. Buferšķīdumu pagatavošana Buferis augiem Fosfātu buferšķīduma pagatavošana: 1. darba šķīdums 0,2M NaH2PO4 - 1,38g/50ml dest H2O 2. darba šķīdums 0,2M Na2HPO4 - 7,16g/100ml dest H2O Sajauc 28ml 1. darba šķīdumu un 72ml 2. darba šķīdumu.

12. Fosfātu buferšķīdums

13. Buferis dzīvnieku audiem Nātrija kakodilāta buferšķīduma pagatavošana (0,2M šķīdums) 2,14g kristāliska nātrija kakodilāta šķīdina 50ml dest. ūdens.

14. Nātrija kakodilāta buferšķīdums

15. Augu audu fiksators un fiksācija: • 1% KMnO4 šķīdums fosfāta buferšķīdumā, pH=7,3. • Lapas gabaliņu 1cm x 1cm ievieto maza izmēra Petri platē ar fiksatoru; • Ar pinceti pietur un sagriež ar skalpeli slejās ar platumu 1mm; • Gabaliņus un fiksatoru ievieto sverglāzītē; • Vajadzības gadījumā pielej fiksatoru, lai 1/3 no glāzītes būtu piepildīta; • Fiksē 1 stundu. • Skalo ar buferšķīdumu 2 reizes pa 3 min.

16. Lapas gabaliņu 1cm x 1cm ievieto maza izmēra Petri platē ar fiksatoru.

17. Gabaliņus un fiksatoru ievieto sverglāzītē

18. Skalošana ar buferšķīdumu

19. Fiksācija skalo paraugus 5 min piesūcina paraugus ar 20% saharozes šķīdumu vismaz 15 min sagatavo darbam saldējamo galdiņu: pievieno pie krāna dzesēšanas sistēmu un atgriež krānu ieslēdz saldējamo galdiņu pēc 3 min uzpilina ūdens pilienu uz piliena novieto paraugu paraugu pārsedz ar sīkiem ūdens pilieniņiem un tos sasaldē ar atdzesētu žileti sagriež paraugu ar preparējamo adatu, pinceti vai žileti pārnes griezumus uz priekšmetstiklu ūdenspilienā izslēdz saldējamo galdiņu no priekšmetstikla ar filtrpapīru atsūc ūdeni uzpilina 2 - 50 mikrolitrus acetoorseīnu, krāso 3 min un pārsedz paraugu ar segstiklu

20. Dzīvnieku audu fiksators un fiksācija • Glutaraldehīda fiksators • 8ml 25% glutāraldehīda ielej mērcilindrā kurā ir 25ml nātrija kakodilāta buferšķīduma • pilina 1M HCl līdz pH sasniedz 7,3 • pievieno destilētu ūdeni līdz 50 ml • Nogriež 1cm3 audu gabaliņu un ievieto sverglāzītē ar fiksatoru. • Fiksē 1 stundu.

21. Fiksācija • skalo paraugus 5 min • piesūcina paraugus ar 20% saharozes šķīdumu vismaz 15 min • sagatavo darbam saldējamo galdiņu: • pievieno pie krāna dzesēšanas sistēmu un atgriež krānu • ieslēdz saldējamo galdiņu • pēc 3 min uzpilina ūdens pilienu • uz piliena novieto paraugu • paraugu pārsedz ar sīkiem ūdens pilieniņiem un tos sasaldē • ar atdzesētu žileti sagriež paraugu • ar preparējamo adatu, pinceti vai žileti pārnes griezumus uz priekšmetstiklu ūdens pilienā • izslēdz saldējamo galdiņu • no priekšmetstikla ar filtrpapīru atsūc ūdeni • uzpilina 2- - 50 mikrolitrus krāsu A, krāso 1 min • ar filtrpapīru atsūc krāsu, uzpilina ūdeni, atsūc šķīdumu • uzpilina krāsu B, krāso 1 min • skalo paraugu kā iepriekš un pārsedz ar segstiklu.

22. Drošības tehnikas prasības darbā ar glutaraldehīdu • Darbu nepieciešams veikt velkmes skapī vai labi ventilējamā vietā; • Darbu nepieciešams veikt gumijas cimdos.

23. Dzīvnieku audu postfiksācija ar osmija tetroksīdu • Audus 2 reizes pa 5 min skalo nātrija kakodilāta buferšķīdumā. • Audus pārvieto osmija tetroksīda fiksatorā (1 daļa natrija kakodilāta buferšķīdums + 3 daļas 4% osmijskābes šķīdums), kurā atstāj uz visu nakti. • Vienai sverglāzītei 1,5 ml fiksatora, t.i. 8 ml fiksatora, 2ml 4% osmija tetroksīds un 6 ml natrija kakodilāta buferšķīdums. • Pēc fiksācijas 2 reizes skalo nātrija kakodilāta buferšķīdumā.

24. Paraugu fiksācija. Ja fiksators ir indīgs, tad fiksē sverglāzītē ar slīpēta stikla aizbāzni.

25. Atūdeņošana • 24% etanola šķīdums skalo 2 reizes pa 5min; • 50% etanola šķīdums skalo 2 reizes pa 5min • 70% etanola šķīdums skalo 1 reizi un pēc skalošanas paraugu uzglabā šādā šķīdumā.

26. Attēls Atūdeņošanai izmantojamie trauki un instrumenti. • Attēls Atūdeņošanas shematisks attēls • Video fragments Atūdeņošana

27. Nepareizi izvēlētas fiksācijas piemēri • Attēls Fiksācijas problēmas 1. • Attēls Fiksācijas problēmas 2. • Attēls Fiksācijas problēmas 3. • Atrodiet vienu kopīgu trūkumu un katram fiksācijas veidam tipisku trūkumu

29. Krāsošana bez fiksācijas • Epidermas šūnu preparātu pagatavošana: • Ar acu pipeti uzpilina vienu pilienu krāsvielas (Acetoorseīns) uz priekšmetstikliņa. • Ar skalpeli uz lapas kāta veido divus iegriezumus tā, lai attālums nepārsniegtu 0,5 cm. Ar pinceti noplēš epidermas gabaliņu un novieto paraugu uz priekšmetstikliņa krāsvielas pilienā. • Pārsedz ar segstikliņu un krāso 5 min. • Ar acu pipeti uzpilina vienu pilienu destilēta ūdens segstikliņa maliņā, bet ar filtrpapīru atsūc krāsvielu no pretējās segstikliņa puses. • Apskata preparātu gaismas mikroskopā ar objektīva palielinājumu 20 reizes. • Kādi ir preparāta trūkumi?

30. Ar skalpeli uz lapas kāta veido divus iegriezumus tā, lai attālums nepārsniegtu 0,5 cm. Ar pinceti noplēš epidermas gabaliņu un novieto paraugu uz priekšmetstikliņa krāsvielas pilienā.

31. Ar acu pipeti uzpilina vienu pilienu destilēta ūdens segstikliņa maliņā, bet ar filtrpapīru atsūc krāsvielu no pretējās segstikliņa puses.

32. Kādi ir preparāta trūkumi?

33. Fiksatori un fiksācija Interneta resursi a) dzīvnieku un augu audu fiksācija gaismas mikroskopijai b) dzīvnieku un augu audu fiksācija elektronu mikroskopijai • Fixation and fixatives Anthony S-Y Leonghttp://home.primus.com.au/royellis/fix.htm

41. Fiksatoru ražotāji un to piedāvājums

42. Pārstāvis Latvijā NOTA BENE - LatvijaRiga, LatviaPhone: 371 7545144, Fax: 371 7553686, E-mail: info@notabene-latvija.lvWebsite: Export Sales and Service

43. Pārstāvis Latvijā