中国棉花主栽品种
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中国棉花主栽品种 DNA 指纹库构建 关键技术研究 PowerPoint PPT Presentation


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中国棉花主栽品种 DNA 指纹库构建 关键技术研究. 汇报人:匡 猛 中国农业科学院棉花研究所. 汇报内容. 一、研究背景 二、指纹库构建研究进展 三、非纯位点与杂株的鉴别 四、重点与难点 五、相关科研成果. 一、研究背景. 2000-2009 年,我国通过国家审定及省级审定的棉花品种数量达 700 多个; 截止到 2014.06.30 ,申请品种权保护的棉花品种数量达 447 个; 少数 骨干亲本的集中使用 ,棉花品种间的遗传差异越来越小; 以 形态性状 进行棉花品种的辨别越来越困难,且形态鉴定 时效性差 ,容易受到 主观与环境因素 的影响;

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中国棉花主栽品种 DNA 指纹库构建 关键技术研究

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Presentation Transcript


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中国棉花主栽品种DNA指纹库构建 关键技术研究

汇报人:匡 猛

中国农业科学院棉花研究所


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汇报内容

  • 一、研究背景

  • 二、指纹库构建研究进展

  • 三、非纯位点与杂株的鉴别

  • 四、重点与难点

  • 五、相关科研成果


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一、研究背景


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  • 2000-2009年,我国通过国家审定及省级审定的棉花品种数量达700多个;

  • 截止到2014.06.30,申请品种权保护的棉花品种数量达447个;

  • 少数骨干亲本的集中使用,棉花品种间的遗传差异越来越小;

  • 以形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难,且形态鉴定时效性差,容易受到主观与环境因素的影响;

    ——

    导致棉花品种多、乱、杂的混乱局面难以得到有效控制,给品种权拥有者、使用者和生产上造成严重损失。


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棉花品种鉴定

田间形态鉴定为主

品种剧增

遗传基础狭窄

迫切需要开发新的鉴定技术

DNA指纹技术

SNP

AFLP

RFLP

RAPD

SSR

棉花品种DNA指纹库构建


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广泛的应用领域

真实性与纯度鉴定

区试品种监控

新品种DUS测试

侵权案司法鉴定

种质资源遗传多样性


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国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMT分子测试指南中,已将构建DNA指纹数据库的方法确定为SSR和SNP,其中SSR标记因其技术比较成熟,已得到广泛的应用。

然而,基于常规聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染技术的检测方法在分析的材料和位点较多时,检测工作显得费时费力,且不同胶板间数据的整合与统计是一项很繁琐的工作,数据结果的准确性也很难保证。


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毛细管电泳检测平台

毛细管电泳检测平台是以不同颜色的荧光染料标记在SSR引物的5′端,荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集,并通过与各泳道的分子量内标进行比对,可自动读取产物片段大小,大大提高检测效率的同时保证了数据的准确性,尤其适用于大规模材料的检测分析与指纹数据库的构建。


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研究进展

本课题在已有的研究基础上,利用36对SSR核心引物,首次采用多色荧光标记检测技术开展我国棉花主栽品种DNA指纹数据库构建的研究工作,开发了棉花DNA指纹数据库软件管理系统,代替人工进行数据统计与分析,使鉴别和研究更快捷、准确,初步建立了高通量的棉花DNA指纹检测与数据分析平台。


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供试材料

初次入库的棉花品种合计138份,其中包括2007—2009年连续3年的农业部全国棉种质量抽查项目获得的,来源于我国三大棉区的主栽品种101份,中棉所(CCRI)系列品种37份(包括4份常规种与11份杂交种及其亲本)。


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部分供试材料基本信息


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荧光峰型表现形式

A.尖锐单峰—41.7%

B.连续多峰—30.6%

C.N+1峰—27.8%

三种主要荧光特异峰峰型


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杂交种峰型特点

亲本1

亲本2

杂交F1

A.双峰 B.三峰 C.四峰


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荧光多重PCR组合的建立

基本原则:

①组合中各引物的扩增产物片段范围不能交叉;

②避开非特异扩增产物峰的相互影响;

③采用多色荧光染料进行标记;

④对于扩增效率较低的引物优先使用FAM进行标记;

⑤选择SSR左右引物中较好的5′端进行荧光标记,尽量避开二聚体结构。


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36对建库所用SSR核心引物构建了9个4重PCR组合,每个组合中的4个引物分别以FAM、HEX、TMR和ROX 4种不同颜色的荧光染料在5′端进行标记。


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荧光多重PCR组合

四色荧光多重PCR组合的毛细管电泳检测效果

注:橙色为分子量内标Liz-500


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棉花DNA指纹数据库软件管理系统

实现了五大功能:

—品种信息查询;

—品种比较;

—亲子鉴定;

—特异性鉴定;

—指纹图谱绘制;


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(1)品种信息查询功能

查询品种基本信息,关联其指纹信息、形态信息及系谱信息


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品种指纹信息


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品种形态信息

品种系谱信息


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(2) 品种比较

品种间两两比对,比对结果显示比较位点数、差异位点数及相似度


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(3) 亲子鉴定

鉴定假设杂交种F1组合与假设双亲间是否存在亲子关系,比对结果显示比较位点数、杂合位点数及亲权排除位点数。


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注:亲权排除位点数≥2个,判定为不具有亲子关系。


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(4) 特异性鉴定

通过设置差异位点数, 将某品种与数据库中其他所有品种指纹进行指纹比对分析,进行特异性鉴定。


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(5)指纹图谱绘制

自动绘制品种模式指纹图谱, 类似于条形码功能;


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同名品种指纹差异分析

  • 相同年份、不同来源的同名品种 ;

    共9对,差异位点数均在0-2个之间—100%;

  • 不同年份、相同来源的同名品种 ;

    共13对,差异位点数:0-2个之间,10对—76.9%;

    4-5个之间,3对---23.1%;

  • 不同年份、不同来源的同名品种;

    共11对,差异位点数:0-2个之间,10对—90.9%;

    11个 , 1对— 9.1%;

  • 相同来源、相同年份、不同批次的同名品种 ;

    共2对,差异位点数:0个;

本研究初步将≥3个差异位点为不同品种的判别标准。

(与即将发布的玉米和水稻分子鉴定国家标准是一致的)


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三、非纯位点与杂株的鉴别

通常所说的品种纯度,实际上是遗传水平上的DNA位点纯合度与种子生产过程中混杂程度的综合表现,混杂样品与非纯位点均表现为不同于主要基因型的异常基因型。然而,种子混杂和非纯位点所反应的现象却有本质的差别。

利用分子标记对主要农作物品种纯度的研究多有报道,但是多将种子混杂和DNA位点的不纯混为一谈,未能有效区分遗传因素和种子生产加工所致的混杂对品种纯度造成的影响,因此无法准确反应品种纯度特性。


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种子混杂(杂株):由生物学混杂、机械混杂或人为掺杂所致,一般情况下,多个位点均表现为不同于主要基因型的异常基因型;

注:7号与9号样品为杂株(均在3个位点表现为异常基因型);


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非纯位点

一方面是由于在传统的遗传育种过程中,育种家侧重对重要农艺性状和易于观察鉴别的植物学特征进行选择,不可能对全基因组施加选择压力,从而导致某些遗传交换频率较低的位点通常保持父母本DNA片段的杂合状态,并在后代群体中保持孟德尔式的遗传分离;

另一方面可能是由于某些品种自交代数不够,部分位点尚未纯合。因此,可以通过增加自交代数,系统选育出位点纯合率高的品种,以提高品种的一致性与稳定性。


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I0 (组合) Aa(100%)

I1 AA(25%) Aa(50%) aa(25%)

I2 AA(37.5%) Aa(25%) aa(37.5%) 注:I1代没有提纯

I3 AA(43.75%) Aa(12.5%) aa(43.75%) 注:I2代没有提纯

I4 AA(46.875%) Aa(6.25%) aa(46.875%) 注:I3代没有提纯

I5 AA(48.4375%) Aa(3.125%) aa(48.4375%) 注:I4代没有提纯

……………………………………………….

  • 非纯位点

注:各世代中等位变异A与a所占比例理论上均符合1:1


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非纯位点

F基因型:编号为1、2、3、10、12、14、15、17 的样品,共8个;

M基因型:编号为 4、5、6、7、8、9、11、13、18的样品,共9个;

杂合基因型:编号为16、19、20的样品,共3个;

1:1卡方适应性测验,χ2 =0.04<χ2(0.01,1)=6.64,此位点的两种等位变异按1:1分离,符合孟德尔遗传分离规律,判定为非纯位点。


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进行棉花品种纯度的SSR标记位点分析时,需区分遗传不稳定所致的非纯位点与生产加工过程中的种子混杂,明确鉴别位点纯合度与种子生产纯度两个指标,才能获得更客观准确的纯度鉴定结果,具有针对性地指导棉花遗传育种、品种审定、种子生产与加工。


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四、重点与难点

棉花作为常异花授粉的四倍体作物,其基因组与遗传背景相对二倍体作物(如玉米和水稻)更为复杂,品种内部的高度一致性很难保证,如何准确鉴别品种间与品种内部剩余变异所致的差异,一直都是未能很好解决的难题。

同时,由于四倍体的特性,不同棉花品种的基因型可能表现为单峰、双峰、三峰及四峰(基于毛细管电泳检测平台),给数据采集与统计分析带了很大的难度与挑战。


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五、科研成果

  • 相关科研论文

  • [1]Meng Kuang, Weihua Yang, Fei Wang. Screening of highly informative and representative microsatellite markers for genotyping of major cultivated cotton variety. Genetics and Molecular Research. (Accepted)

  • [2]Yucui Zhang, Meng Kuang, WeihuaYang etal. Construction of a primary DNA fingerprint database for cotton cultivars, Genetics and Molecular Research.12 (2): 1897-1906 ,2013

  • [3]匡 猛,杨伟华*,许红霞等.中国棉花主栽品种DNA 指纹图谱构建及SSR 标记遗传多样性分析,中国农业科学. 44(1):20-27,2011

  • [4]匡 猛, 杨伟华*, 许红霞等.中国棉花主栽品种DNA指纹数据库初步构建研究,棉花学报. 24(3):229-237,2012

  • [5]匡 猛,杨伟华*, 张玉翠等.棉花杂交种纯度的SSR标记检测及其与表型鉴定的相关性,作物学报,37(12):2299-2305,2011

  • [6]匡 猛,杨伟华*,许红霞等.基于棉花SSR的多色荧光标记检测技术,分子植物育种(网络版). (9):1240-1244,2011

  • [7]匡 猛,杨伟华*,许红霞等.单粒棉花种子DNA快速提取方法.分子植物育种,8(4):827~831.,2010

  • [8]匡 猛,杨伟华*,许红霞等.分子标记技术在棉花品种鉴定上的研究进展.棉花学报,21(4):330~334,2009

  • [9]王 飞,匡猛,许红霞等. 7个棉花品种SSR 位点纯合度研究与分析.棉花学报. 25(3):234-239,2013

  • [10]张玉翠,杨伟华,匡 猛等. 32个棉花主栽品种DNA指]纹图谱构建及遗传多样性分析. 棉花学报. 24(2):120-126,2012

  • [11]张玉翠,杨伟华,匡 猛等..SSR分子标记在棉花研究中的应用.安徽农业学,40(3):1321-1323,2012

  • [12]王俊芳,杨伟华,匡 猛等.棉花品种指纹图谱构建及棉种鉴定技术研究.中国棉花,36(3):6-9,2009


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六、科研成果

获得授权发明专利3项,

实用新型专利1项,

计算机软件著作权1项。


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小结

棉花品种DNA指纹数据库的建立,不仅对保护棉花育成品种的知识产权和育种家的权益、提供棉花种子真实性和纯度的司法鉴定具有重要意义,而且对规范品种管理,提高市场的种子质量水平,控制品种多、乱、杂,打击假冒伪劣,维护棉花生产和棉农利益以及进一步清理我国棉花种质亲缘关系等方面都是非常必要的。

然而,DNA指纹数据库的构建及应用是一个复杂的系统工程,涉及多方面的问题还有待进一步的深入研究。


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致谢

感谢农业部种子管理局、农业部种植业司、全国农技推广中心对本研究的大力支持;

基金项目:

中央级公益性科研院所基本科研业务费重点项目(SJA1204);

农业部农产品质量安全监管(种子管理)项目;

国家科技支撑计划(2011BAD35B09);

国家棉花产业技术体系(CARS-18-24 );

项目合作单位:

华中农业大学林忠旭课题组; 山东棉花中心张军课题组;

南京农业大学蔡彩平课题组;


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谢谢


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