4. Miško medžių genetinė inžinerija

1. 4. Miško medžių genetinė inžinerija 4.1. Genetinės inžinerijos samprata (genų identifikacija ir rekombinantinė DNR). 4.2. Genetinės inžinerijos metodai. 4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai. 4.4. Genetinės inžinerijos taikymo ypatumai miškų ūkyje.

2. a) b) c) d) e) 4.1. Genetinės inžinerijos samprata Genų inžinerija (sin. genetinė modifikacija) tai dirbtinė genų modifikacija ląstelėje ir nelytinio genų perkėlimo metodų naudojimas tikslinei požymių, produktų ir procesų modifikacijai (FAO 2004). • Genetinė modifikacija tai tikslingas svetimų genų įterpimas. • Genetiškai modifikuotas organizmas (GMO)- tai organizmas į kurio genų visumą (genomą) yra įterptas svetimas genas (ai). Genetinės modifikacijos principas- svetimų genų įterpimas (a) bakterijos DNR molekulė, (b) bakterijos DNR sukarpoma spec. enzimų pagalba (c) naujas genas (d) naujas genas įstatomas į DNR grandinę (e) genetiškai modifikuota (rekombinuota) DNR molekulė. 4.1. Genetinės inžinerijos samprata (1)

3. Genomika: genų identifikacija • Norinti modifikuoti požymio genetinį sąlygotumą reikia identifikuoti su požymio išraiška susijusius genus. • Genomika tai palyginti nauja genetinių tyrimų šaka, kurios pagrindinis tikslas yra identifikuoti genus ir jų funkcijas. • Pagrindiniai genų identifikacijos etapai: • Požymio ir molekulinio žymes ryšio ir požymių genų lokusų nustatymas • Kandidatinių genų identifikacija, DNR sekvenavimas ir genų ekspresijos skirtumai. • Genomo sekų analizė ir kodono pirmumo principas.

4. m M G g a) QTL paieška 20% • Kai kurie požymį sąlygojantys genai turi didesnę įtaką ar įtakuoja kitų genų veiklą (vadinami kiekybinio požymio lokusais arba QTL). • Požymių ir molekulinių žymenų sąsajos tyrimų tikslas rasti žymenis susijusias su šiais genais, galutinis tikslas- rasti pačius genus. ŽymuoM 50% QTL1 Požymio ir žymens sąsaja testuojama per rekombinaciją: lytinų ląstelių formavimo metu iš tėvo ir motinos gautos porinės chromosomos pasikečia dalimis. Galimi 4 genotipai: M-G; M-g; m-G; m-g Požymis kontroliuojami eilės genų, kurių įtaka išreikšta procentais (pavyzdžiui kuo didesnis procentas tuo daugiau medienos) QTL2 15% ŽymuoN 5% 5% a) žymuo M ir genas G nesusiję nes rekombinacijos metu pateko į skirtingas sankibos grupes b) žymuo m ir genas g yra susiję nes rekombinacijos metu pateko į vieną sankibos grupę 5%

5. Išreikšta iRNA cDNA DNR microgardelės: hibridizacija su žinomų genų dalimis b) Genų paieškos principai Genų ekspresijos tyrimas (skirtingos aplinkos ar skirtingi funkciniai audiniai)  polimorfinių cDNR identifikacija  sekų nustatymas  atitikmenų paieška bibliotekose ar mikro gardelėse  geną žyminčių žymenų kūrimas (EST). Už žiedinių struktūrų brandinimą atsakingų genų paieška atliekama tikrinant genų ekspresiją pumpuro užuomazgos ir vegetatyviniuose audiniuose Sekvenavimas cDNR cDNR atitinkančių genų paieška bibliotekose Specifinės sekos žyminčios abi geno puses naudojamos kaip žymenys GTATAGGTCTCTGT Žinomų genų dalių DNR gardelė Kandidatinio geno seka

6. 0 1,000 2,000 3,000 4,000 2.0 1.5 1.0 0.5 -0.0 2.0 1.5 1.0 0.5 -0.0 2.0 1.5 1.0 0.5 -0.0 0 1,000 2,000 3,000 4,000 c) Genų paieška DNR sekose Sekmenuotose genomuose galima ieškoti jau žinomų genų atitikmenų naudojantis informatikos priemonėmis. Kodono pirmumo principas taikomas sekvenuotų genomų tolesnėje analizėje. Žinant tam tikra medžio biocheminėje sudėtyje gausaus baltymo pagrindinę amino rūgštį, kompiuterio pagalba galima ieškoti DNR atkarpų, kuriuose vyrauja šią amino rūgštį koduojantis tripletas (kodonas, pvz. CUG). Analizės metu, tiksliniam kodonui suteikiamas pirmumas ir pagal kodono pasikartojimo dažnį apskaičiuojant kodono pirmumo rodiklis, kuris identifikuojamas kaip intronas ir baltymą koduojančio geno dalis. Kodono pirmumo rodiklis

7. Restriktazės Restriktazės tai specialūs baltymai, kurie sukarpo DNR molekulę specifinių DNR nukleotidų sekų radimosi vietose. DNR iš medžio A DNR iš medžio B Cukraus 5 C atomas per fosfatų grupę jungiasi su sekančio nukleotido cukraus 3 C atomu. Žymėjimas 5’ ir 3’ nurodo cukraus C atomus. iRNR “nuskaito” DNR kodą 5 3 kryptimi Būtent restriktazių tikslaus sukarpymo metodo atradimas davė pagrindą rekombinantinės DNR sukūrimui ir genetinei modifikacijai Ta pačia restriktazė sukarpytos 2 skirtingos DNR molekulės gali suformuoti jungtis ir sudaryti naują DNR molekulę. 4.1. Genetinės inžinerijos samprata (3)

8. Rekombinantinė DNR Įterpiamas naujas genas Rekombinantinė DNR tai dirbtiniu būdu sukurta DNR molekulė, įterpiant naują geną ar jo dalį. Bakterijos DNR (plazmidė), į kurią įterptas naujas genas • Bakterijų DNR plazminės ir tikslinis genas sukarpomi tomis pačiomis restriktazėmis. • Genas įvedamas į bakterijos plazmidę: geno ir bakterijos plazmidės DNR atkarpų galai atitinka vienas kito jungčiai ir genas inkorporuojamas į bakterijos plazmidę. • Užkrėtus augalo ląsteles, bakterijos plazmidė migruoja į augalo ląsteles ir įsiterpia į jų DNR tuo pačiu įvesdama naują geną. 4.1. Genetinės inžinerijos samprata (2)