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第二节 DNA 复制的酶学

第二节 DNA 复制的酶学. DNA 复制的体系 底物： dNTP (dATP 、 dGTP 、 dCTP 、 dTTP) ； 聚合酶 (polymerase) ：依赖 DNA 的 DNA 聚合酶， 简写为 DNA-pol 或 DDDP ； 模板 (template) ：解开成单链的 DNA 母链； 引物 (primer) ：提供 3´-OH 末端的寡核苷酸； 其他的酶和蛋白质因子. 一、 DNA 聚合酶 催化 dNTP 聚合到核酸链上的酶。是 DNA 复制的主要酶。

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第二节 DNA 复制的酶学

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Presentation Transcript

  1. 第二节 DNA复制的酶学

  2. DNA复制的体系 底物：dNTP (dATP、dGTP 、 dCTP 、dTTP) ； 聚合酶(polymerase)：依赖DNA的DNA聚合酶， 简写为DNA-pol或DDDP； 模板(template)：解开成单链的DNA母链； 引物(primer)：提供3´-OH末端的寡核苷酸； 其他的酶和蛋白质因子

  3. 一、DNA聚合酶 催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。 全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指 导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。

  4. (一) DNA聚合酶催化的反应 1. 5´至3´的聚合活性 催化四种dNTP一个一个地接到DNA 链上去。 (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi

  5. 聚合反应机理：

  6. 聚合反应的特点： (1) 以单链DNA为模板 (2) 以dNTP为原料 (3) 引物提供3´-OH (4) 聚合方向为5´→3´

  7. 5´→3´外切酶活性： 切除引物 切除突变的片段 2.核酸外切酶活性 3´→5´外切酶活性： 切除错配的核苷酸 ？

  8. (二) DNA聚合酶的种类 1. 原核生物的DNA聚合酶

  9. DNA-pol I: • 单一肽链的大分子 • 曾被称为复制酶(replicase) • 含量最多 • 可被水解成两个片段 • 小片段(N端)：具有5´→3´外切酶活性； • 大片段(C端)：具有聚合活性和3´→5´ 外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。

  10. DNA-pol III: • 由10种亚基组成的不对称聚合体 • 催化效率最高

  11. 2. 真核生物的DNA聚合酶 DNA-pol 复制中延长随从链 DNA-pol 没有其他pol时才起作用 DNA-pol 催化线粒体DNA的复制 DNA-pol 复制中延长领头链 DNA-pol 校读、修复和填补缺口

  12. (三) 复制的保真性(fidelity) 至少依赖三种机制： 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能； 3. 复制中的即时校读功能。

  13. 二、解旋解链酶类 解开并理顺DNA双链，维持DNA 处于单链状态。主要有解螺旋酶、 DNA拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。

  14. (一) 解螺旋酶 (helicase): 　模板对复制的指导作用在于碱基的准确 配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供 能，解开DNA双链。

  15. 　　复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、dna C… …dna X 　　相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C … …Dna X Dna A：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结 合并打开双链。

  16. (二) 单链DNA结合蛋白 (SSB): SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。在大肠杆菌，它是由177个氨基酸残基组成的 同四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷 酸单位。 SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制 中维持模板处于单链状态。

  17. (三) DNA拓扑异构酶 (topoisomerase): 拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保 持物体不变的性质。 拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑性质 的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又 能连接磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋， 有利于DNA解链。

  18. 拓扑异构酶I（topo I）: • 在原核生物曾被称为－蛋白。 • 主要作用是切开DNA双链中的一股，使 DNA解链旋转中不打结，DNA变为松弛 状态再封闭切口。

  19. 拓扑异构酶II（topo II）: • 在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。 • 能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参 与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接 断端。

  20. 三、引物酶和引发体 引物酶 (primase): • 依赖DNA的RNA聚合酶。 • 催化RNA引物的合成。 • 在大肠杆菌，引物酶是dna G基因的产物。 RNA引物： 　　在DNA模板的复制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA 聚合提供3´-OH末端。

  21. 引发体 (primosome): • 是由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制 因子一起形成复合体，再结合引物酶形成 较大的聚合体，结合到模板DNA上。 • 复制开始时，在引发体的下游解开双链， 再由引物酶催化引物的合成。

  22. 四、DNA连接酶（DNA ligase） 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P 末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP。 ATP

  23. DNA连接酶在复制、DNA修复、 重组、剪接中均起缝合缺口作用。 是重要的工具酶之一。

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