移植与免疫
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移植与免疫. 天津市第一中心医院 东方器官移植中心 张建军. 主要内容. 一、移植免疫学历史 二、免疫学概念回顾 三、移植免疫 四、排斥反应 五、免疫耐受 六、未来移植免疫学发展的方向. 一、移植免疫学历史. 器官移植是 20 世纪医学发展最伟大的成果之一。 世界肝移植之父美国 Starzl 教授预言器官移植将占 据 21 世纪的手术室。 器官移植是衡量一个国家医学水平的标准。. 器官移植的历史. 1 、血管吻合技术的突破 2 、器官保存技术的发展 3 、移植免疫的进展. 1 、血管吻合技术.

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移植与免疫

天津市第一中心医院

东方器官移植中心

张建军


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主要内容

  • 一、移植免疫学历史

  • 二、免疫学概念回顾

  • 三、移植免疫

  • 四、排斥反应

  • 五、免疫耐受

  • 六、未来移植免疫学发展的方向


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一、移植免疫学历史

器官移植是20世纪医学发展最伟大的成果之一。

世界肝移植之父美国Starzl教授预言器官移植将占 据21世纪的手术室。

器官移植是衡量一个国家医学水平的标准。


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器官移植的历史

  • 1、血管吻合技术的突破

  • 2、器官保存技术的发展

  • 3、移植免疫的进展


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1、血管吻合技术

  • 1902年Alexis Carrel发表《The operative technique for vascular anastomoses and transplantation of viscera》一文,阐述了血管缝合的基本技术。

  • 1906年和1908 Carrel先后完成了猫的双肾移植术和双肾切除后的单肾移植术,证实单肾移植可以维持生命。

  • 1912年获得诺贝尔生理学医学奖。


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血管吻合技术

  • 由于 Carrel等的努力,血管吻合技术得以突破,建立了血管直接吻合和血管套接两种方法。从此无论动物模型的建立还是临床器官移植都得到较大发展。

  • 50至60年代,人同种异体器官移植获得成功。


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2、移植免疫学的进展

1596年,意大利外科医生成功进行最早一次成功的自体组 织移植.

19世纪初,尝试异体皮肤移植,但因排斥而失败。

1945年,Medawar用皮肤移植实验探讨排斥机制。证实了同种异体移植排斥是一种免疫现象. 提出体液免疫和细胞免疫.最早将全身性放疗作为抗排斥方法。


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1954年哈佛大学Murray等首次完成同卵双生姐妹间的肾移植,证实了组织适合性的重要。 1990年他们获诺贝尔奖。

E Donnall Thomas 1920 --; Joseph Murray 1919--

Nobel Prize in 1990


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  • 1960年Goodwin使用氨甲喋呤(M.T.X)、环磷酰胺

  • 1962年Calne使用硫唑嘌呤降低排斥现象

  • 1963年Starzl 在肾、肝移植中使用抗淋巴细胞血清来减低淋巴细胞作用而降低排斥现象。


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George Davis Snell,Baruj Benacerraf ,Jean Dausset

Nobel Prize 1980

小鼠 MHC = H-2

人 MHC = HLA

…….

…….


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  • 随后Calne和Murray使用硫唑嘌呤再加上类固醇,作为抗排斥方法。

  • 1976年,Calne证实环孢素A选择性作用于T淋巴细胞、而没有骨髓抑制作用。

  • 81年Cosimi使用单株抗体降低排斥反应。

  • 1984年,FK506 (抗免疫抗生素)被发展起来。

  • 1991年,Rapamycin则进入临床试验阶段。


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免疫学概念回顾

  • 免疫系统的作用

  • 免疫系统的构成

  • 免疫细胞的组成及其识别

  • 免疫分子的分类、组成与作用

  • 免疫应答的效应方式与特征


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免疫系统的作用

  • 免疫系统的作用是保护机体免遭病原体感染

  • 免疫作用方式分两类

    天然性免疫应答(innate immune response)

    适应性免疫应答(adaptive immune response)


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免疫系统的构成

  • 免疫系统是由相应的免疫分子、细胞、组织与器官构成

  • 主要的淋巴器官与组织分为一级(中枢)和二级(外周)


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  • 一级淋巴器官是淋巴细胞发育的场所

    胸腺是T细胞发育的场所

    骨髓和胚肝是B细胞(哺乳类)的发育场所

  • 二级淋巴器官和组织包括包膜化器官(脾和淋巴结)及非包膜化淋巴组织(主要指粘膜表面的淋巴组织,即MALT)


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免疫细胞的组成及其识别

1 天然性免疫免疫细胞

  • 单核/巨噬细胞

  • 多形核粒细胞

  • 血小板

  • 自然杀伤细胞(NK)

2 适应性免疫系统的细胞

  • 抗原递呈细胞(APC)

  • 淋巴细胞

3 免疫细胞的CD标识系统来自小鼠的单克隆抗体分析人白细胞抗原


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免疫分子的分类、组成与作用

  • 补体

  • 细胞因子:干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、集落刺激因子(CSF)、趋化性细胞因子、肿瘤坏死因子(TNF)

  • 抗体

  • 抗原


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免疫应答

  • 包括两个主要的时相↗识别抗原

    ↘产生清除抗原的反应

  • 识别时相:在适应性免疫应答中由淋巴细胞负责,通过克隆选择涉及识别特异抗原的细胞发生增殖

  • 效应时相:对各种类型的病原体可启用不同的免疫效应机制,如中和作用、吞噬作用、细胞毒性反应


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三、移植免疫

概念 :

移植:是用手术或其他方法将细胞、组织或器官从原部位移植到自体或异体的一定部位,以替代或补偿移植部位所丧失的结构与功能。

移植物(graft):被移植的细胞、组织或器官

供者(donor):提供移植物(graft)的个体

受者(recipient):接受移植物者。


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不同个体间移植常引起受者对移植物的免疫排斥应答,这种免疫现象称为移植免疫。

移植免疫学是研究排斥反应发生的机制,如何防治排斥反应的发生以维持移植物的正常功能和长期存活。


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  • 1、 分类:

根据供受者间遗传背景的差异分为:

1.自体移植

2.同系移植

3.同种移植

4.异种移植


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移植类型

自体移植(autologous transplantation)


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同系移植 (isograft)

单卵双生间、纯系动物间的移植


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同种异体移植(isogeneic transplantation)

同种间不同个体的移植,具遗传基因、MHC差异


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异种移植(heterogous transplantation)

异种动物间的移植:种间差异性更大


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2、移植排斥反应的抗原 :

一.抗原

引起移植排斥反应的抗原称为组织相容性抗原,它存在于机体所有有核细胞的表面。它有主要和次要之分:能引起强烈排斥反应者称为主要组织相容性抗原,引起较弱排斥反应者称为次要组织相容性抗原。

1、 主要组织相容性抗原(MHA)

HLA-I类Ag:HLA-A、HLA-B、HLA-C,

HLA-II类Ag:HLA-DR、DQ、DP


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H-2 抗原 (H-2 antigens):小鼠的MHC 抗原(MHC antigens of mouse)。

HLA:意为人白细胞抗原(human leukocyte antigens):系指人的MHC 抗原 (MHC antigens of man), 首先在白细胞表面检测到 ( first detected on leukocytes)。现乏指人的MHC或MHAS。


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2、次要组织相容性抗原(mHA)

①与性别相关的H-Y抗原

②非Y染色体连锁的mH抗原:HA-1~HA-5

3、ABO、Rh血型Ag

4、组织特异性Ag : 独立于HLA抗原和ABO血型抗原之外的特异性地表达于某一器官、组织或细胞表面的一类抗原系统。如内皮细胞(VEC)的特异性抗原和皮肤的SK抗原。


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●组织相容性是指不同的个体间进行组织器官移植时,供者和受者双方相互接受的程度。●编码最强移植抗原的基因座位即为主要组织相容性复合体(MHC),其编码的抗原即为主要组织相容性抗原。●主要组织相容性抗原主要表达在细胞膜表面,是引发同种移植排斥反应最主要的抗原。

主要组织相容性基因复合体 ( MHC ):单一染色体上编码MHAS的一组基因 ( Group of genes on a single chromosome encoding the MHC antigens)。


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HLA复合体及其编码的产物

  • HLA复合体位于6号染色体的短臂上,其分布范围大约3600~4000 kb,含有至少10个基因位点

  • 根据基因和编码产物的结构和功能的不同,将HLA复合体分为三个区域,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因区


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MHC分子结构示意图

MHC-I

MHC- II

Peptide-binding region

a2

a1

a1

b1

a3

b2m

a2

b2

immunoglobulin-like region

Transmembrane

region


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3、移植排斥反应的过程及机制 :

受者对移植物排斥反应的三阶段:

A、致敏或识别过程

B、增殖反应和分化过程

C、效应杀伤过程


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A、致敏或识别过程

中枢致敏:移植物脱落细胞、可溶性抗原 淋巴组织

激活受者免疫细胞致敏

外周致敏:循环T细胞 移植物局部 接触致敏

直接抗原呈递途径(早期排斥):移植抗原不需受者APC而直接刺

激T细胞。如移植物MHC, 移植物MHC+多肽 (移植物细胞成

APC) →导致CD8+ CTL 活化

间接抗原呈递途径:

移植抗原 受者APC呈递 受者T细胞

MHCI Tc

IFN-g IL-2

MHCII CD4+T pTc Tc 

B AFC


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受者T淋巴细胞

供者APC

受者APC

直接和间接识别

间接识别

直接识别


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B、增殖反应和分化过程

供受者的免疫活性细胞 移植物 局部淋巴结肿大,淋巴细胞数量增加,MLR、T、B均参与反应

C、效应杀伤过程

1. CD4+ T活化、Mf动员,迟发性超敏反应

2. CD8+ T活化成CTL杀伤移植物靶细胞。

3. Ab与移植物Ag结合成复合物激活补体。

移植物的损伤和功能丧失,

T细胞在移植排斥反应过程中是主要的。


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移植排斥的损伤机制

APC

供者细胞

TNF-β、

IFN-γ

IL-2

TC

IFN-γ

TH

IL-10 、

IL-4

IL-2

IL-5

IFN-γ

活化

活化

抗体

抗体

抗体

NK

B

补体

CTL

NK

补体依赖细胞毒

细胞介导细胞毒

ADCC

炎症反 应


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四、排斥反应

1、排斥反应的类型

  • 超急性排斥

  • 急性排斥

  • 慢性排斥

排斥

宿主抗

移植物反应

移植物

抗宿主反应


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2、排斥反应的速度


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  Kidney Transplantation Graft Rejection


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移植肝慢排:血管内皮增生,增厚


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移植肝慢性排斥反应,汇管区胆管萎缩

移植肝慢性排斥反应 胆管消失,

移植肝慢排:胆管消失(角蛋白染色显示胆管上皮消失)


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3、移植物抗宿主反应:

(Graft-versus-host reaction,GVHR)

被移植的组织或器官中含有免疫细胞,在宿主免疫功能低下的情况下,来自供者的淋巴细胞将对宿主体内的同种异型抗原(尤其是HLA抗原)发生免疫应答,产生移植物抗宿反应甚至发生移植物抗宿主病。

常发生于胸腺、骨髓移植患者,也见于肝脏移植的病人。


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Graft versus host disease


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Graft versus host disease 


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Acute graft-versus-host reaction with vivid palmar erythema


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Late, chronic graft-versus -host reaction with hyperpigmented sclerotic plaques on the back


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Graft-versus-host reaction with early, chronic, diffuse, widespread lichenoid changes of lips


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4、排斥反应的防治

1.选择合适的供者

1)ABO血型(必) 须符合

2)HLA 配型:HLA-DR,HLA-A,HLA-B

3)淋巴细胞毒交叉配合实验( 即受者血清中抗供者HLA抗体测定)

受者血清+供者LC+补体 计数死细胞

2.免疫抑制

3.诱导免疫耐受


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防止移植排斥反应的主要措施:

1. 正确的组织配型,选择合适的供者

同胞兄妹:四分之一

非血缘:四百万分之一~千万分之一

⑴ 组织配型(tissue typing):用血清学和分子生物学方法对供者和受者进行HLA组织型进行鉴定,以确保他们HLA相似或者相同。经验证明:同种肾脏移植时,HLA-DR配型最为重要,HLA-B、A次之。


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移植中的组织配型

(一)选择组织相匹配的供者

1、一般情况(供物状态、全身情况、年龄)

2、ABO血型相容(拟输血)

3、HLA相容性(受、供者HLA等位基因相合的数目越多越好)

(二)HLA相容程度测试

1、血清学分型

2、细胞学分型

3、基因分型


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1、血清学分型:

原理—利用各种已知的HLA标准血清型,

与检测细胞反应,添加补体后观察

细胞反应(CDC)~

(micro-complement dependent cytotoxicity)

技术要点—分离淋巴细胞,与标准抗血清

反应,添加补体,死细胞染色

记数、判断

评价—较理想,标准抗血清难~


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2、细胞学分型—采用淋巴细胞混合培养(MLC),分双向/单向。

  • 双向MLC—受、供体淋巴细胞混合体外培

    养,彼此作用,观察细胞形态

    与细胞增殖,互不影响示受、

    供体间HLA型相匹配,否则~

    技术要点—分离计数彼此淋巴细胞,共孵

    育,染色计数转化细胞~

    评价—用于移植前的交叉配合试验,但不

    能判定HLA-D型~


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  • 单向MLC—用已处理的标准型细胞与测试

    细胞共孵育,观察测试细胞的

    反应。

    标准型细胞为只表达LD抗原的细胞,经丝裂

    霉素C或X线处理失去增殖能力,作为刺激细

    胞,与测试细胞孵育,观察测试细胞的增殖

    反应,称纯合子细胞分型试验(HTC)。测

    试细胞无增殖反应示彼此相同,又称阴性分

    型试验。


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当标准型细胞为只能对单倍型细胞具有识别

而增殖的现处于静止状态的淋巴细胞,经预

处理后成为致敏淋巴细胞(PL),作为反应

细胞,与测试细胞孵育时,经测试细胞的刺

激使PL转化、增殖,又称其为阳性分型试验

( PLT)。

HTC/ PLT—均为单向MLC,技术要点类同双向~,但有许多预处理等~。

评价—实际但繁琐、技术要求高~


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3、基因分型

①限制性片段长度多态性(RFLP)分型

②聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针~

(PCR-SSOP)

③PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)分型

④PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分型

⑤PCR指纹图谱技术

⑥其他


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①限制性片段长度多态性(RFLP)分型:

利用不同个体的HLA相应碱基序列不同,

其内源性酶切位点不同,经同一组内切酶的

酶切反应后,出现酶切片段的个数、长短不

一(酶切图谱)。——与已知型的比对、分

析——用以定型。


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②聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针~

(PCR-SSOP):

将待检细胞HLA基因片段经PCR扩增、产

物转移至尼龙膜上,再与核素标记的特异性

寡核苷酸探针进行杂交,——结合完好说明

其基因序列相似(互补)。


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③PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)分型:

先设计特异性引物(SSP),因为此SSP只能

和相应的等位基因特异性片段的碱基序列互

补结合~

④PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分型:

相同长度的单链DNA,其碱基顺序不同即便只

有单个碱基不同,经不变性的中性聚丙烯胺

凝胶电泳后,可反映不同的空间构象(泳动

速度、迁移率)。


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⑤PCR指纹图谱技术:

DNA指纹图是指,由于不同个体的DNA具有不

同的分子构象,其在非变性聚丙烯胺凝胶电

泳中呈现的特异性区带图谱。

操作步骤是,先分别得到供者/受者的DNA指

纹图;然后将得到供者和受者的混合DNA指纹

图,并作一致性比较分析~


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(三)交叉配型试验

  • 目的:检测受者体内是否存在抗供者的特异性抗体以及受者对供者HLA抗原的相容程度。

  • 技术要点:供者淋巴细胞+受者血清

    (混合)供者淋巴细胞+受者淋巴细胞

    等等

    方法:1、微量细胞毒试验,2、流式细胞

    术,3、混合培养,4、CML~


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(2)交叉细胞毒试验 :受者的血清与供者白细胞混合后做间接免疫荧光试验以排除受者体内有事先产生的抗供者抗体的可能性;

供者白细胞

受者的血清

荧光标记的兔(羊)抗人抗血清

间接免疫荧光试验


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荧光显微镜下观察


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2.移植物和受者预处理

⑴ 保存液灌流等以去除移植物中的过路细胞;

⑵ 血浆置换术等去除针对血型抗原的抗体、受者脾脏切除、免疫抑制

3.正确使用免疫抑制疗法

⑴ 糖皮质激素、环孢素A(cyclosporin A,CsA)、FK506和细胞毒性药物等免疫抑制药。

⑵ 生物制剂:ALG、ATG、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗TCR等。


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免疫抑制

1、免疫抑制药物:主要问题:感染

(1)类固醇:副作用大、易致感染

①促进T细胞死亡以减少T细胞,但主要针对未成熟胸腺细胞,对成熟T细胞影响很小。

②阻断炎性细胞因子如IL-1、IL-6、TNF的转录、合成、释放、具有抗炎作用。

(2)代谢抑制剂:硫唑嘌呤、环磷酰胺、抑制造血干细胞,非特异性全面抑制淋巴细胞和其它白细胞。


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(3)真菌代谢产物,效果较好

  • ①环孢霉素A(CsA):真菌多孢木霉菌产出的11环肽,TH强抑制剂,选择性抑制TH活化增殖和TC的分化成熟,抑制细胞免疫;减低MHC分子的表达。

  • ②FK-506:筑链霉菌产物,抑制TH释放IL-2、IL-4。主要针对活化的T细胞,对休止期T细胞影响较小。

  • ③雷帕霉素:与CsA相似,但抑制抗体产生的能力比CsA强。


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2、抗体制剂:抗人淋巴细胞血清、抗胸腺细胞免疫球蛋白、抗CD3单抗、抗CD25(IL-2R)单抗、抗粘附分子抗体(抗CD80、抗ICAM、抗VCAM)。

  • 问题:过敏反应,多用而失效——人抗鼠抗体反应。

  • 克服方法:基因工程抗体


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3、全身淋巴组织照射、清除淋巴细胞,造成类似胎儿或新生儿的不成熟免疫状态,从而易于诱导免疫耐受。

4、阻断移植抗原诱导同种免疫应答的启动,如给受者在移植前诸如可溶性同种异型MHC分子或其片段,封闭反应性TCR。


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五、免 疫 耐 受

1、 免疫耐受的概念

2、免疫耐受的形成及表现

3、免疫耐受的机制

4、免疫耐受与临床医学


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  • 移植排斥的特殊情况

  • 免疫豁免区——机体的某些部位易于接受同种甚至异种组织器官移植,不发生或仅发生轻微的排斥反应。如角膜、软骨、脑、胎盘滋养层、胸腺、睾丸等。

  • 1.      生理屏障

  • 2. 抑制性细胞\因子 TGF-b inhibit Th2, IL-4IL-10 inhibit Th1


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1、免疫耐受的基本概念

免疫耐受(immunological tolerance)是指机体免疫系统接触抗原后导致的特异性免疫无应答性和低应答性。


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2、免疫耐受的形成及表现

A、胚胎期及新生期接触抗原所致免疫耐受

----天然免疫耐受现象

B、后天接触抗原导致的免疫耐受


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A、胚胎期及新生期接触抗原所致免疫耐受

----天然免疫耐受现象

1)Owen 的观察

1945年异卵双生牛:血型嵌合体(chimeras),互不排斥

2)Medawar等的实验证实---实验性免疫耐受

1953年,Medawar:获得性免疫耐受

胚胎期接触同种异型Ag诱导免疫耐受的形成

胚胎期、新生期易诱导耐受

成年期困难得多


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B、后天接触抗原导致的免疫耐受的影响因素

1)抗原方面的因素

2)机体方面的因素


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1)抗原方面的因素

耐受原 — 诱导产生免疫耐受的抗原

1. 抗原的剂量:高剂量TI 低区带(low-zone)耐受性

高、低剂量TD

高区带(high zone)耐受性

2. 抗原的性质:分子结构简单的小分子抗原

理化性状:非聚合体

3. 抗原注射的途径:口服、静脉注射易耐受

耐受分离(split tolerance):口服诱导局部粘膜免疫,但

致全身耐受。

4. 抗原在体内的持续时间:单次注射缓慢分解易耐受

5. 抗原决定基特点


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2)机体方面的因素

耐受原 — 诱导产生免疫耐受的抗原

1.免疫系统的成熟度:新生期、胚胎期易耐受

2. 动物的种属和品系:小鼠、大鼠易建立

3. 免疫抑制措施的影响:

(1)x-ray

(2)胸导管引流

(3)单抗

(4)免疫抑制剂:环磷酰胺、FK506等 .


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T、B细胞免疫耐受的特点


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3、免疫耐受机制

A、中枢耐受

1)T细胞克隆在胸腺中的缺失(阴性选择)

2)B细胞克隆缺失

B、外周耐受

1)克隆无能或免疫忽视

2)免疫抑制细胞的作用

3)免疫隔离部位的抗原在生理条件下不致免疫应答


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免疫耐受与免疫抑制及免疫缺陷的比较


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未来移植免疫学发展的方向


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外科技术日臻完美


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移植免疫处于幼儿期

  • 免疫抑制的非特异性导致地免疫状态

  • 终身服用免疫抑制药物所致的昂贵费用、药物副作用。

  • 免疫耐受的机制

  • 慢性排斥反应的机制


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异种移植---未来最有前途的方法


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异种移植过程中的超急排斥反应(HAR)

HAR是异种移植的首要障碍,是人体内一些天然抗体(natural antibody)所介导的。

这些天然抗体识别猪组织细胞表面的异种抗原(xenoantigen),尤其是表达于血管内皮细胞表面的半乳糖成分 a-1,3-半乳糖苷 (Gala-1,3Gal)。

天然抗体与血管内皮细胞结合后激活补体,手术后几分钟至数小时之内就可导致移植器官血管栓塞、坏死。


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激活补体

天然抗体 [人]

半乳糖成分 a-1,3-半乳糖苷 (Gala-1,3Gal) [猪]

血管内皮细胞

手术后几分钟至数小时之内就可导致移植器官血管栓塞、坏死。


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抑制 HAR 的可能途径

用含有蔗糖转移酶的缓冲液术前对器官进行灌流,对Gala-1,3Gal加以修饰使其在结构上与人的糖基十分类似,不再被人天然抗体所识别;

在术前用带有 Gala-1,3Gal 糖基的微球柱吸附清除宿主血清中的天然抗体;

*抑制补体在被移植组织细胞表面的活化;

*将a-1,3半乳糖苷转移酶基因敲除;


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1 敲除a-1,3半乳糖苷转移酶基因

基因敲除 ( knock out )

半乳糖苷转移酶基因

mutation

半乳糖苷转移酶基因

缺陷细胞株

transfection

Homo-recombination

screening

胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)


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半乳糖苷转移酶基因–

人CD46、CD55和CD59基因+

Transgenic pig (animals)


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敲除a-1,3半乳糖苷转移酶基因

表达人CD46、CD55和CD59等*** ***

“转基因工程猪”的制备

DNA

受精卵


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转基因技术取得突破 ,数千病人有望换上动物器官


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小 结

1、移植免疫的历史与现状

2、免疫学的概念

3、移植免疫

4、排斥反应

5、免疫耐受

6、未来移植免疫学发展的方向


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谢 谢!

思考题:

1、移植免疫学的进展中有里程碑意义的突破有那些?请列举三件

2、排斥反应的分类及特点?


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