Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 16

Klasifikasi , Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase PowerPoint PPT Presentation


  • 339 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Klasifikasi , Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase. Abdul Arifin 20508013. Klasifikasi DNA Ligase. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB). Enzim Nomenklatur. DNA Ligase (ATP). EC.6.5.1.1. Struktur molekul. Definisi ;

Download Presentation

Klasifikasi , Mekanisme dan Aplikasi Enzim DNA Ligase

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

Klasifikasi, MekanismedanAplikasiEnzim DNA Ligase

Abdul Arifin

20508013


Klasifikasi dna ligase

Klasifikasi DNA Ligase

Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology

(NC-IUBMB)

EnzimNomenklatur

DNA Ligase (ATP)

EC.6.5.1.1

Strukturmolekul

Definisi;

DNA Ligase: salahsatuenzimligase yang membentukikatankovalenfosfodiesterdiantaraujung 3’Hidroksi darisatunukleotidadenganujung 5’fosfat darinukleotida yang lain danmelibatkan ATP dalamreaksinya.

SisiAktif (Lysine)

MekanismeReaksi

SecaraUmum;

(DNA)n + (DNA)m (DNA)n+m

DNA Ligase

ATP

AMP + Ppi


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

Mekanisme DNA Ligase

NH-AMP

DNA ligase

PP1

NMN

E.coli

T4

ATP

NAD+

NH2

AMP

DNA ligase

Ligated DNA

Suaturantai DNA yang terpisah

Transfer gugusadenosilkeujung 5’ fosfatpada DNA yang terpisah

Gugushidoksilmenyerangujung 5’ fosfat – adenosil - enzim

Pembentukan intermediate enzimenergitinggidengan transfer gugusadenosildari NAD+atau ATP padagugus amino dariresidu lysine


Tipe tipe dna ligase

Tipe-tipe DNA Ligase

  • PadaHewanMamaliaterdapat 4 tipespesifikdarienzim DNA Ligase, diantaranya ;

  • DNA Ligase I : yang mengkatalisreaksiligasifragmen-fragmen Okazaki padapemanjanganrantaisewaktuprosesreplikasi DNA berlangsungdanbeberapafragmen-fragmenrekombinasi

  • DNA Ligase II : Bentuk alternative dari DNA Ligase III yang ditemukanpadasel yang tidakdapatmembelahdiri

  • DNA Ligase III : Bentukkompleksdengan XRCC1 suatu protein yang memperbaiki DNA denganmencegahterjadinyamutasipenghilanganbasa DNA danfragmen-fragmenrekombinan

  • DNA Ligase IV : Bentukkompleksdengan XRCC4. Kompleksenziminimengkatalisistahapakhirprosesperbaikanpenggabunganujung non-homolog DNA rantaiganda.

Umumnya enzim-enzim DNA ligase pada mulanya ditemukan dalam T4 bakteriofag, E. coli dan bakteri lainnya.


Regulator dna ligase

Regulator DNA Ligase

Regulation of DNA Ligase activity by poly(ADP-ribose) yang disusun

oleh Debbie Creissendan Sydney Shall dalam Nature 296, 271-272 (18 March 1982)

Nuclear ADP-ribosyltransferase (ADPRT) menkatalisis transfer ADP-ribosdari NAD+

ke protein Kromatinuntukmembentuk mono-,oligo-, and poly (ADP-ribose)-termodifikasi. Enziminisangattergantung DNA untukaktivitasnyadandiaktivasidenganadanyacelahdalam DNA. Hal inimengindikasikanbiosintesis poly(ADP-ribose)n dibutuhkanuntukperbaikan yang efektifuntukbeberapajeniskerusakan DNA.

Regulation of inter- and intramolecular ligation with T4 DNA ligase in the presence of polyethylene glycol yang disusunoleh Hayashi, K., et. al., yang dipublikasikandalam

Nucleic Acids Research, 1986, vol. 14, No.19 7617-7631

Polyethylene glycol (PEG) mempengaruhireaksiligasipada T4 DNA ligase. Dalam 10% (w/v) larutan PEG 6000, hanyaligasiintermolekular yang dipertinggiolehkation-kationmonovalent, sementarareaksiligasi inter- danintramolekulardapatterjaditanpa PEG. 

Cell cycle regulation of a DNA ligase-encoding gene ( CaLIG4) from Candida albicans

DisusunolehAndaluz, E., et. al., yang dipublikasikandalam Yeast volume 15 issue 12, 1999, p1199-1210

menjelaskantingkattranskripsienzimCaLIG4dalamC. albicansbervariasiselamasiklusselragi. Sel-sel yang baruterbentukmengandungtingkattranskripsibasa yang meningkatsampaitingkatmaksimumketikaseldalamkeadaan G1akhir. Sesudahitu, tingkatranskripsimenurunketikareplikasi DNA dimulai.


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

IsolasidanKarakterisasi DNA Ligase

Isolasi gen DNA ligasedariThermococcus sp. 1591

Denaturasi

pisahkan gen DNA ligasemenjadi DNA rantaitunggaldenganpemanasan 94oC selama 1 menit

gabungkan primer kerantaitunggal DNA, dengansuhu 50oC/140 detik

Annealing

Primer merupakanurutandaerahdari DNA ligaseorganisme x

pembentukanrantaikeduadengan DNA polymerase dandNTPpadasuhu 72oC selama 1,5 menit

Extension

Dilakukan PCR sampai 40 siklus, Fragmen yang dihasilkan (total panjang 600nt), yang miripdengan gen DNA ligaseorganisme x


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

DNA Thermococcus sp. 1591

Isolasi gen DNA ligasedariThermococcus sp. 1591

Primer 1 and 2

Membentuk gen utuh.

Gen DNA ligaseutuh


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

KarakterisasiDNA Ligase

Aktivitasligasedapatditentukanmelaluiduametode

Salahsatusampelditambahkan DNA ligase

1.Molekul DNA kontrol

2. DNA setelahpenambahanenzimrestriksiBstEII

3. Samaseperti 2, tetapisebelumelektroforesissampelnyadipanaskan 70oC selama 10 menit

4. Sampelfragmen DNA + BstEIIdenganpenambahan DNA ligase (45oC/1jam), buffer reaksiserta ATP

5. Miripdengan 4 tetapitanpa ATP

C = produkligasi (fragmen A + B)

A dan B= fragmenhasilrestriksiBstEII


Aplikasi dna ligase

Aplikasi DNA Ligase

Percobaanpertama DNA rekombinan

  • 1971 ilmuwanmemanipulasi DNA danmenempatkannyakedalambakteri

  • 1972 ilmuwanmenggabungkanduamolekul DNA darisumberberbedamenggunakanendonucleaseEcoRI (untukmemotong) dan DNA ligase (untukmenggabungkankembali)


Aplikasi dna ligase1

Aplikasi DNA Ligase

Kloning DNA pertama

  • Boyer, Helling Cohen, dan Chang menggabungkanfragmen-fragmen DNA dalamsebuah vector, danmentransferkeselE. coli

  • Cohen and Chang menyimpulkan, merekadapatmenempatkan DNA bakterikedalamspesiesbakteri yang berlainan

  • Tahun1980 Boyer and Cohen menerima paten untukmetodedasartransformasidankloning DNA


Aplikasi dna ligase2

Aplikasi DNA Ligase

DNA ligasedimanfaatkanuntukmenggabungkansecarakovalenikatanfragmen-fragmensuatu DNA, secaraluaskemampuaninidiaplikasikankepenggabungansuatufragmen DNA padasuatuvektor plasmid, halinimerupakanteknikdasarrekombinasi DNA

OrganismaModifikasiGenetik: Aplikasi DNA Ligasedalam Agriculture

Agrobacterium

DNA mengandung gen yang diinginkan

Plant cell

1

2

3

Tiplasmid

Regenerasitanaman

RekombinanTi plasmid

Pemasukan gen kedalam plasmidmenggunakanenzimrestriksidan DNA ligase

pengenalanke dalam sel tanaman yang dikembangkan

T DNA

T DNApembawagen barudalam kromosom tanaman

Tanaman hasil rekayasa

Titikrestriksi


Perkembangan aplikasi dna ligase

PerkembanganAplikasiDNA Ligase

1

Isolat DNAdari dua sumber

Sel Manusia

E. coli

2

Potong kedua DNA dengan enzim restriksi

yang sama

Plasmid

DNA

Gen V

Sticky ends

campurkan DNA; merekabergabung berdasarkan pasangan basanya

3

Paul Berg, Stanley N. Cohen & Herbert Boyer, 1970 (p.1119)

Klon DNA : (teknologi DNA rekombinanataurekayasagenetik)

1. Potong DNA padaposisitertentudenganenzimrestriksiendonuklease.

2. Gabungkankeduafragmen DNA denganDNA ligase.

3. Pilihmolekulkecil yang mampumereplikasiDNAnyasendiri. Potongan DNA dapatdimasukkankedalamkloningvektor (plasmid atau viral DNA) untukmembentukDNA rekombinan.

4. Pindahkan DNA rekombinandaritabungteske sell indukuntukreplikasi.

5. Identifikasi cell induk yang mengandung DNA rekombinan.

4

DNA ligase menggabungkanikatan DNA secara kovalen

Gen V

Rekombinan DNAplasmid

5

plasmid dimasukkan ke bakteri

6

bakteri diklon

Klon bakteri mengandung duplikat gen manusia


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

“BerasKeemasan” telahdimodifikasisecaragenetik agar meengandung beta-karotene

Berasinidapatmenolongmencegahterjadinyadefisiensiterhadap vitamin A

KloningSel-selHewan,

Langkahmenujugen terapi

Tanamantembakakau, diekspresikandengan gen firefly luciferase

TikusRekayasa (Kanan), yang diekspresikan

dengan gen HGH (Human Growth Hormone)


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

Sel-seldanorganismerekombinandigunakanuntukmenghasilkan protein-protein yang bermanfaat


Klasifikasi mekanisme dan aplikasi enzim dna ligase

Kesimpulan


  • Login