Atp adenozin trifoszf t meghat roz s a tca trikl racet t extrakci s m dszerrel
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 13

ATP ( adenozin-trifoszfát ) meghatározás a TCA ( triklóracetát ) extrakciós módszerrel PowerPoint PPT Presentation


  • 50 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

ATP ( adenozin-trifoszfát ) meghatározás a TCA ( triklóracetát ) extrakciós módszerrel. az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik

Download Presentation

ATP ( adenozin-trifoszfát ) meghatározás a TCA ( triklóracetát ) extrakciós módszerrel

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Atp adenozin trifoszf t meghat roz s a tca trikl racet t extrakci s m dszerrel

ATP (adenozin-trifoszfát) meghatározás a TCA (triklóracetát) extrakciós módszerrel


Adenozin trifoszf t

az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható

allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik

allosztérikus: az enzim nem csupán a szubsztrátkötésre alkalmas katalitikus hellyel rendelkezik, hanem még egy vagy több más, olyanhellyel is, ahol kicsiny, a szubsztráttól eltérő szerkezetű, szabályozó molekula, effektor vagy ligand megkötése válik lehetségessé (allosztéria = más alakú) 

az ATP a legfontosabb molekula a sejtekben lejátszódó energia leadó és felvevő folyamatokban, az elhalt sejtekben az ATP gyorsan degradálódik → a mikrobiális aktivitás becslésére használható paraméter

a talajból kivonható, majd mennyisége meghatározható

adenozin-trifoszfát


A meghat roz sra alkalmazott m dszerek

  • legelterjedtebb: az ATP biolumineszcens reakciója segítségével (luciferin-luciferáz rendszer)

    • gyors módszer

    • nagyon érzékeny kimutatás

  • HPLC módszerrel

    • nem elterjedt

    • sok időt vesz igénybe az analízis

    • drága a szükséges felszerelés

A meghatározásra alkalmazott módszerek


Az atp biolumineszcens reakci ja

A lumineszcencia olyan kémiai folyamat, ahol a molekula energia hatására gerjesztett állapotba kerül, majd alapállapotába visszajutva, fényt bocsát ki.

  • az ATP a biokémiai reakció során luciferin-luciferáz enzimpreparátum hatására lebomlik, miközben biolumineszcencia (fénykibocsátás) történik

    • az enzim reakcióba lép az élő szervezetek – mikrobák – energiataroló komponensével, az ATP-vel

    • a reakció során oxiluciferin-luciferáz-AMP komplex képződik, amely oxidálódik

    • a gerjesztett állapotban levő átmeneti komplex (*-gal jelölve) energiatöbbletét a normál állapotba visszatérve foton formájában adja le

Az ATP biolumineszcens reakciója


A reakci egyenletek

  • A kibocsátott fény - műszeresen – luminométer segítségével detektálható

    • minél erősebb a fényintenzitás, annál magasabb az ATP-tartalom, a mérés rendkívül érzékeny, hiszen 10-13 g ATP már kimutatható

A reakcióegyenletek


El ny k h tr nyok

  • Előnyök:

    • rendkívül kis mennyiségű ATP jelenléte már nagy biztonsággal kimutatható

    • rendkívül gyors vizsgálati módszer (a reakció 10 másodpercen belül lejátszódik)

  • Hátrányok:

    • az ATP extrakciós hatásfoka erősen függ

      • a használt extraháló szertől

      • az ATPáz és ATP kináz enzimek inaktivitásának sebességétől és intenzitásától

      • az ATP adszorpciójától a talaj szerves és ásványi kolloidokon

    • a talaj kivonatokban található különböző vegyületeknek (pl. NO3- Mg2+, Ca2+, Cl-) gátló hatása lehet a luciferáz aktivitására

    • néhány vegyület (pl . Fe3+) komplexet alakít ki az ATP-vel

    • a talajban az ATP-t ki lehet vonni növények gyökereiből és állati sejtekből is a mikrobiális sejtek mellett (az az ATP interferál a mikrobiális aktivitással)

      Sok fajta ATP extrakciós módszert használnak:

    • az egyik ilyen: a TCA (triklóracetát) extrakciós módszer

Előnyök - hátrányok


A tca trikl racet t extrakci s m dszer

A TCA (triklóracetát) extrakciós módszer

A módszer elve:

az ATP extrakciója a talajból triklóracetát- foszfát- paraquat keverék segítségével, majd a kivont ATP mennyiségi meghatározása a luciferin-luciferáz rendszerrel

Szükséges anyagok és készülékek

  • luminométer és küvetták

  • ultrahangos és egy 12.5 átmérőjű szonda

  • minicentrifuga (Eppendorf centrifuga és csövek)

  • jégfürdő

  • szűrő (Whatman 44)

  • pH mérő

  • finnpipetta és steril csíkok

  • üvegcsövek

  • polipropilén vagy üveg centrifuga csövek

Szükséges anyagok és oldószerek

  • EDTA-magnézium arzenát puffer

  • TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat

  • Luciferin-luciferáz keverék

  • belső standard ATP-oldat (10-3 M)


Az oldatok elk sz t se

  • EDTA-magnézium-arzenátpufferoldat

    • 1.oldat: 31,2 g Na2HAsO4·7H2O-et kell feloldani 800 ml vízben, majd hozzáadni 10 ml 0,2 M EDTA oldatot

    • 2. oldat: 2,46 g MgSO4·7H2O-t kell feloldani 100 ml desztillált vízben

    • a két oldatot össze kell önteni és 7,4-es pH-ra beállítani 1 M kénsav segítségével , majd 1000 ml-re kiegészíteni desztillált vízzel, hogy az oldat 0,1 M legyen az arzenátra nézve, 10 mM a Mg2+-ra és 2 mM az EDTA-ra

  • TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat

    • 81,6 g TCA-t és 89,6 g Na2HPO4·12H2O-t kell feloldani 600 ml desztillált vízben

    • 25,8 g paraquat-dikloridot (1,1-dimetil-4,4-bipiridilium-diklorid) kell feloldani 100 ml desztillált vízben és ezt a TCA-Na2HPO4 oldathoz adni

    • az így elkészült oldatot vízzel ki kell egészíteni 1000 ml-re, hogy az oldat 0,5 M legyen a TCA-ra nézve, 0,25 M a foszfátra és 0,1 M a paraquatra

    • Az oldat pH-ja 1,6 lesz és -15 ºC-on kell tárolni

Az oldatok elkészítése


Az oldatok elk sz t se1

  • Luciferin-luciferáz keverék

    • a tisztított luciferáz és a D-luciferin liofilizált keverékét fel kell oldani 2 ml desztillált vízben injekciós üvegenként a gyártó utasításai szerint (Packard Instrument Co.)

  • ATP belső standard oldat (10-3 M)

    • 5,07 g savmentes ATP-t kell feloldani 7 ml steril extraháló szerben, majd kiegészíteni az extraháló szerrel 10 ml-re

    • minden 0,5 ml ATP oldatot helyezzük egy-egy steril Eppendorf csőbe és tároljuk -20 ºC-on

Az oldatok elkészítése


Az elj r s

  •  ATP extrakció

    • 4 adag nedves talaj mintát (<2 mm szemcseméret), amelyek mind 2,5 g szárított talajt tartalmaznak, be kell mérni 50 ml-es polipropilén (vagy üveg) centrifugacsőbe és jégen kell hagyni

    • 25 ml hideg TCA-foszfát-paraquatextrahálószert kell adni mindegyik kémcsőbe

    • Két kémcsőbe belső standard ATP oldatot kell tenni

    • ezek után a talajt 1 percig kell szonikálni a 12,5 mm átmérőjű szondában a BransonSonifier B12 készülékkel, a szonda csúcsa 1 cm-re legyen a folyadék felülete alatt

    • az ultrahangos kezelés után a kémcsöveket hűteni kell jégen legalább 5 percig, majd szűrni

    • a szűrt kivonatokat lehet tovább használni

Az eljárás


Az elj r s1

  • Az ATP meghatározása

    • a talajszűrletethez (50μl) hozzá kell önteni 5 ml EDTA-MG arzenát pufferoldatot és jégen tartani a törzsoldatot

    • a luciferin-luciferáz keverékből 50μl-t a küvettába kell pipettázni, majd a luminométeren lemérni ezt a vakmintát (az intenzitása nem lehet nagyobb 150 RLU/10 s-nál, RLU (relativelight unit))

    • ezután 250 μl-t kell adni a jegelt törzsoldatból a küvettába, majd háromszor mérni egy percen belül a készülékkel a minta intenzitását

  • A kalibrációs görbe

    •  A belső standard ATP oldatból küvettákban hígítással kell készíteni egy sorozatot, amelyek ATP koncentrációja rendre legyen 10-5, 10-6, 10-7 és 10-8 M

    • majd mérni ezen kalibrációs minták intenzitását

Az eljárás


Sz mol s s hasznos tan csok

  • ATP (μg)/ dwt (g) = (A*ATPS*40) / (B-A)

    • A: a talajszűrlet minta intenzitása

    • ATPS: hozzáadott belső standard mennyisége [μg]

    • B: a belső standard oldatból készült minta intenzitása

    • dwt: a száraz tömege 1 g nedves talajnak

  • A paraquat használata nem szükségszerű, mivel hozzáadása csak segíti az extrakciós hatásfok javítását. Nagy hátránya a használatának, hogy erősen mérgező anyag és drága is.

  • Nem lehet alkalmazni ezt a módszert, ha a talaj több, mint 10% CaCO3 tartalmaz (semlegesíti a TCA-oldatot)

  • Vizsgálat előtt el kell távolítani a mintából a látható növényi gyökereket és az állati szöveteket, mert a módszer az ezekben található ATP-t is megméri.

Számolás és hasznos tanácsok


Felhaszn lt irodalom

  • Élelmiszervizsgálati közlemények (1997. XLIII. kötet 2. füzet)

    • http://www.eoq.hu/evik/evik97-2.pdf

  • Redox-potenciál mérésén alapuló gyors mikrobiológiai módszer validálása és ipari alakalmazhatóságának vizsgálata - Nádaskiné dr. Szakmár Katalin

    • http://phd.lib.uni-corvinus.hu/403/1/szakmar_katalin.pdf

  • Mikrobiális fiziológia – Novák Béla

    • http://www.cellcycle.bme.hu/oktatas/mikrofiz/extra/metabolizmus_regulacio.pdf

  • Alef K. and Nannipieri P. (Editors): MethodsinAppliedSoilMicrobiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995

    • Estimation of adenosinetriphosphateinsoils

    • The trichloroaceticacidextractionmethod

Felhasznált irodalom


  • Login