以含鉻黃血鹽修飾細小碳糊電極製造 葡萄糖 感測器

1. 以含鉻黃血鹽修飾細小碳糊電極製造葡萄糖感測器 蔡君賢、胡真熏、林浩 南台科技大學化學工程與材料工程系 摘要 本研究利用含鉻黃血鹽修飾碳糊電極，在還原電位下，偵測過氧化氫或葡萄糖之電流應答，並藉此推算過氧化氫或葡萄糖之濃度。結果顯示，其對於偵測過氧化氫之線性關係良好（線性範圍為0.01 ~ 15 mM，R2 = 0.9997），且其催化還原過氧化氫之靈敏度約為151.3 µA/cm2-mM H2O2。若將含鉻黃血鹽奈米化並用以修飾碳糊電極，其靈敏度約提升13倍（1.98 mA/cm2-mM H2O2），線性範圍可達約0.005 ~ 17 mM，R2 = 0.9995；顯示含鉻黃血鹽有助於增加催化過氧化氫之還原能力，且將此人工酵素奈米化，更能大幅提升催化過氧化氫之還原能力，增大電流應答。而含鉻黃血鹽修飾碳糊電極若以Chitosan包埋固定葡萄糖氧化酵素，其對葡萄糖感測之線性範圍為0.025 ~ 1.625 mM（R2 = 0.9993），靈敏度為23.11 µA/cm2-mM C6H12O6。 關鍵字：葡萄糖感測器、含鉻黃血鹽、細小碳糊電極、逆微胞合成法、過氧化氫 前言 結果與討論 糖尿病近年來已竄升為國人十大死亡原因之一，它所帶給國人健康危害及醫療資源的耗損已相當嚴重。自我監測血糖對糖尿病患者而言是不可或缺的，紀錄日常生活的血糖值，可以將合併症之發生及病情惡化減至最低。因此發展一種輕便、快速、經濟且精確度高之可攜式血糖感測器已是一大需求。 由於許多生理物質，可藉由其特定之氧化酵素催化，產生過氧化氫（如圖一）。故利用電子傳媒（mediator），在還原電位下催化過氧化氫之還原反應，由產生電流訊號之大小，即可得知過氧化氫之濃度，進而推知生理物質的濃度[1]。而選擇在還原電位下操作，目的在於避開生物體液中具有電化學活性（在氧化電位下，易被氧化）的物質干擾，使其訊號擁有專一性[2]。 此外，在此反應機制下，可藉由不同之氧化酵素，催化對應之生理物質產生過氧化氫，因此亦可將此機制應用於製備不同種類之生醫感測器。 幾丁聚醣（chitosan）是一種生物性高分子，具有良好之成膜性、增黏性、分散性，而其薄膜有良好之透氣性、滲透性[3]及尺寸大小選擇性[4]，可用以排除較大分子之干擾物（如尿酸、乙醯胺酚）進入至電極表面發生反應，因而能提高對小分子待測物之專一性。此外，其生物相容性好，且無毒性，不易使受固定之酵素失去活性。 本研究除了探討含鉻黃血鹽對過氧化氫還原之催化能力之外，亦利用逆微胞合成法[5-6]製備奈米級含鉻黃血鹽粉體，期望能藉由奈米粒子極大的比表面積特性以增加對過氧化氫還原之催化能力。此外，亦利用幾丁聚醣來包埋固定葡萄糖氧化酵素而製備葡萄糖生醫感測電極以測試其對葡萄糖之感測能力。 粉體粒徑之量測： 循環伏安圖之比較： 圖三 (a) A電極；(b) B電極 在含有0.1 M KCl 之4 mL, pH 7.35, PBS溶液中，通氮除氧後，自 -0.6 V至0.6 V掃引40個區段之循環伏安圖 圖二 以(a)共沉法；(b)逆微胞法 製備含 鉻黃血鹽之雷射都卜勒粒徑分析圖 過氧化氫之偵測： 葡萄糖之偵測： 圖一 葡萄糖酵素電極之偵測原理 圖四 (a) A電極；(b) B電極 在4 mL, pH 7.35, PBS溶液中，通氮除氧後，在-150 mV下，每隔50秒注入20 μL, 100 mM H2O2之Time-Base圖及檢量線圖 圖五 酵素電極在4 mL, pH 7.35, PBS溶液（含0.1 M KCl）中，自-0.6 V至0.6 V，掃引速率50 mV/s，掃引60個區段之循環伏安圖 酵素電極干擾物之測試： 實驗 2.1 儀器裝置與藥品 本研究利用三電極裝置（參考電極為Ag/AgCl；輔助電極為圈繞Pt絲），連接至電化學分析儀（BAS-100W）繪製循環伏安圖與偵測電流應答。另使用雷射都卜勒粒徑分析儀（ZETASIZER 3000 Hs）量測粒子粒徑。所用的藥品有黃血鹽 、氯化鉻、碳粉 (關東化學)、異辛烷 、AOT (Dioctyl Sulfosuccinate, Sodium salt, ACROS)、葡萄糖氧化酵素 (Glucose Oxidase, GOD, EC 1.1.3.4 Type X-S from Asperagillus niger, 50000 units/mg, Sigma)、幾丁聚醣（Chitosan, from Chitin MW.~75000, 95% deacetylation ）、小牛血清蛋白 、過氧化氫。以上試藥均為分析級。 2.2 含鉻黃血鹽的製備 2.2.1 共沉法 分別配製相同莫耳數之氯化鉻與黃血鹽溶液，快速混合、攪拌，得到含鉻黃血鹽膠體溶液。經大量超純水反覆洗滌，去除雜質後，乾燥備用。 2.2.2 逆微胞合成法 分別配製相同莫耳數之氯化鉻與黃血鹽溶液，再分別量取等體積之溶液，依適當比例與AOT、異辛烷混合（ω0 = 24），氯化鉻及黃血鹽各自形成逆微胞系統。將兩個逆微胞系統快速混合、攪拌，即可得到含鉻黃血鹽逆微胞溶液。再經適量超純水反覆洗滌，去除界面活性劑與副產物後，乾燥備用。 2.3 工作電極之製作 取一長約7 cm，其線芯直徑約為0.05 cm之單芯電線，將兩端分別去除0.5 cm之絕緣層（裸露線芯之表面積為0.0805 cm2），將裸露部份經徹底清洗乾淨後備用。再將先前製備好之含鉻黃血鹽粉體與碳粉、印刷油墨依適當比例均勻混合。最後將調製好的碳糊均勻塗佈在先前備妥之電線一端。 2.4 酵素電極之製備 利用磷酸鹽緩衝溶液配製2000 U/µL之GOD溶液，並加入15 %之BSA。取2 µL此溶液均勻塗覆在先前製備之含鉻黃血鹽修飾碳糊電極之表面。待酵素溶液乾燥後，再於電極表面均勻塗覆5 µL 2.5 %之幾丁聚醣醋酸水溶液，室溫下乾燥後，即可製得葡萄糖感測電極。 2.5 檢測環境條件 將所製得之工作電極（以共沉法製備之含鉻黃血鹽所修飾之碳糊電極、以逆微胞法製備之含鉻黃血鹽所修飾之碳糊電極，以下將分別稱為A電極、B電極）與Ag/AgCl、圈繞之Pt絲組成三電極系統，於30 ± 0.2 ℃, 4 mL, pH 7.35, PBS溶液中，繪製循環伏安圖（CV圖），並以Time-Base（定電位）模式偵測H2O2或葡萄糖之電流應答。 圖六 酵素電極在4 mL, pH 7.35, PBS溶液中，在-150 mV下，每隔100秒注入10 μL, 100 mM Glucose之Time-Base圖 圖七 酵素電極在4 mL, pH 7.35, PBS溶液中，在-150 mV下，對不同干擾物質之檢測圖 表一 奈米化與未奈米化之電子傳媒修飾碳糊電極之靈敏度比較 結論 本研究選用含鉻黃血鹽作為電子傳媒，其偵測過氧化氫之線性關係，不論是否被奈米化，均有不錯之線性範圍及靈敏度。而奈米化之含鉻黃血鹽對於催化還原過氧化氫的能力，明顯優於未奈米化之含鉻黃血鹽。此結果顯示，含鉻黃血鹽有助於增加催化還原過氧化氫之能力，且將含鉻黃血鹽奈米化後，更能大幅提升催化還原過氧化氫之能力，增加電流應答，且具有極佳之靈敏度及偵測極限。因此應用於製備電流式生醫感測電極，將具有極大之優勢及潛力。而利用包埋法固定酵素，所製得之酵素電極對於偵測葡萄糖雖有不錯之線性範圍及靈敏度，但仍有改進空間，且鑑於含鉻黃血鹽對於催化H2O2還原之能力甚佳，相信如果再改良酵素固定的方式，必能提升對偵測葡萄糖之靈敏度及線性範圍，而此部份的研究也將是我們持續努力的方向。 參考文獻 [1] 彭振育、張良謙、林浩、李錦厚，”含鈷赤血鹽修飾碳糊電極應用於電流式感測器”，中國材料科學學會2003年年會暨國科會研究成會， 會，2003。 [2] 施偉仲，”還原型葡萄糖生化感測器之發展研究”，淡江大學化學學系碩士論文，1997。 [3] Luo, X. L.; Xu, J. J.; Du, Y.; Chen, H. Y., “A glucose biosensor based on chitosan-glucose oxidase-gold nanoparticles biocomposite formed by one-step electrodeposition ,” Anal. Biochem., Vol.334, pp.284, 2004. [4] Yang, M.; Yang, Y.; Liu, B.; Shen, G.; Yu, R., “Amperometric glucose biosensor based on chitosan with improved selectivity and stability,” Sensors and Actuators B, Vol.101, pp.269, 2004 . [5] Luisi, P. L., “Enzymes hosted in reverse micelles in hydrocarbon solution,”Angew. Chem. Int. Ed. Engl., Vol.24, pp.439, 1985. [6] 賴龍標，”鉑奈米結構電極之製備”，國立成功大學化學工程所博士論文，2001。 南台科技大學 化學工程研究所