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Mini-Revisão

Mini-Revisão. Mini-Revisão. Começando a decifrar. Ciclo Lítico do Fago l. Ciclo Lítico do Fago l. Ciclo Lítico do Fago l. O fenômeno de restrição-modificação. Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962

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Presentation Transcript

  1. Mini-Revisão

  2. Mini-Revisão

  3. Começando a decifrar...

  4. Ciclo Lítico do Fago l

  5. Ciclo Lítico do Fago l

  6. Ciclo Lítico do Fago l

  7. O fenômeno de restrição-modificação Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962

  8. Enzimas de restrição

  9. Clivagem de restrição

  10. Clivagem de restrição

  11. Sítio de Restrição

  12. Nomenclatura das enzimas de restrição EcoRI Escherichia coli BamHIBacillus amyloliquefaciens RH BglIIBacillus globigii PvuIIProteus vulgaris HindIIIHaemophilus influenzae Rd HinfIHaemophilus influenzae Rf Sau3AStaphylococcus aureus AluIArthrobacter luteus TaqIThermus aquaticus HaeIIIHaemophilus aegyptius NotI Nocardia otitidis-caviarum

  13. Fracionamento de DNA

  14. Mapa de Restrição

  15. Utilização do Mapa

  16. Detectar mutações

  17. Comparação de Mapas

  18. Fracionamento de DNA

  19. Como reconhecer o fragmento de interesse?

  20. Complementariedade

  21. Hibridação Calor ou pH = desnaturação

  22. Reassociação Temperatura e força iônica

  23. Sonda

  24. Marcação da sonda Ou com Polinucleotídeo Quinase

  25. Estringência • Reação de Hibridação e Lavagem: • especificidade da sonda • tamanho da sonda • temperatura (T’m) • força iônica Especificidade : identidade de seqüência Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo Temperatura: T’m - 25oC Força iônica: NaCl

  26. Southern blot

  27. Resultado

  28. Hibridação in situ Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro Em azul claro os núcleos corados com DAPI

  29. Hibridação in situ

  30. Southern blotAnimação

  31. O que fazer com o fragmento? Clonagem de DNA A clonagem permite a eternizar o fragmento Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser produzido por um procarioto.

  32. Vetores de clonagem O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem? 1. Replicação autônoma 2. Marcas de seleção 3. Sítio para clonagem

  33. Sítio de clonagem O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas. Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.

  34. Plasmídio recombinante

  35. Transformação Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção, multiplicação

  36. Hospedeira transformada

  37. Clonagem molecular

  38. Outro vetor? Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb. YACs - fragmentos maiores ainda.

  39. Biblioteca GenômicaGenoteca

  40. Varredura de biblioteca

  41. Seqüenciamento de DNA Princípios

  42. Reação em cadeia de polimerização 1. Replicação

  43. PCR 2. Amplificação

  44. PCR - ANIMAÇÃO Um momento, por favor, estou carregando o programa.

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