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La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF). v = velocità di migrazione della proteina in un campo elettrico E = forza del campo elettrico z = carica netta della proteina f = coefficiente frizionale = 6 r  = viscosità del mezzo. v=E · z · f -1. 3500 V. proteine acide

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


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La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF)

v = velocità di migrazione della proteina in un campo elettrico

E = forza del campo elettrico

z = carica netta della proteina

f = coefficiente frizionale = 6r

 = viscosità del mezzo

v=E·z·f-1

3500 V

proteine acide

proteine basiche

catodo

anodo

+

+

+

+

pH3

pH10

-

step1

step2

-

step3

-

pI, punto isoelettrico  Z=Ø  v= Ø

Sample preparation

First dimension

Second dimension

Detection

Image Analysis

MALDI-TOF MS

ESI MS/MS

Tot 76 kVh

Parma , 8 Novembre 2001


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Sample preparation

First dimension

Second dimension

Detection

Image Analysis

MS analysis

Perché la I° dimensione è così importante nella 2-DE ?

Una I° dimensione eccellente assicura che gli spots (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella II° dimensione, anche quando una grande quantità di proteine viene analizzata

Perché le IPG strips sono così importanti nella I° dimensione ?

  • il gradiente di pH immobilizzato è stabile ed evita il fenomento della “catodic drift” ;

  • se sono noti i valori di pI delle proteine d’interesse, l’intervallo di separazione IEF viene ristretto e ne consegue un’analisi estremamente mirata (>accuratezza e precisione) ;

  • elevata risoluzione proteica ;

  • alta riproducibilità dei risultati ;

  • le proteine estremamente acide o basiche sono più facilmente separabili ;

  • IPG buffers con stesso intervallo di pH delle IPG strips sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre o elimina il background nella colorazione del gel ….

I° dimensione : l’importanza

Parma , 8 Novembre 2001

La I° dimensione : IPG strips

Immobilized PH Gradient strip = IPG strip


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La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE

1.

La miscela proteica è sottoposta a :

H3C-(CH2)10-CH2OSO3-Na+

Sodio dodecil solfato (SDS)

= detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti delle proteine native

+

Mercaptoetanolo e ditiotreitolo

= riducono i ponti disolfuro

2.

Gli anioni dell’SDS si legano alle catene principali in un rapporto di :

~ 1 molecola SDS • 2 residui di amminoacidi

3.

 I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa  MM proteica

I° dimensione : l’importanza

Parma , 8 Novembre 2001

Nella II° dimensione in condizioni denaturanti(“elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE”) le proteine sono separate in un gel di poliacrilamide in base alla loro massa molecolare (MM)

  • Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal catodo- all’anodo+ in base alla loro MM


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La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE

- CATODO

IPG strip

-

Gel di poliacrilamide

+

45 mA

+ ANODO


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I° DIMENSIONE (IEF) :

II° DIMENSIONE (2D-PAGE) :

12 IPG strips / corsa

12 gels / 4-6 ore

10 gels / 15-20 ore

12 IPG strips / corsa

Hoefer DALT unit (APB)

Multiphor II (APB)

Ettan DALT II System (APB)

IPG Phor (APB)

Giorno 1

Giorno 2

Giorno 3

Giorno 4

Giorno 5

16.00

13.00

12.00

17.00

16.00

t

9.30

Equilibrazione

Equilibrazione

Reidratazione o.n.

Separazione IEF

Preparazione 2°dimensione

Preparazione 2° dimensione (GELS)

Preparazione 2° dimensione

Separazione 2D-PAGE

Fissazione e colorazione

Analisi 2DE : le apparecchiature

Parma , 8 Novembre 2001

Sistemi di analisi 2DE - strumenti


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2DE : vantaggi vs svantaggi

Vantaggi vs vantaggi

Parma , 8 Novembre 2001

Parma , 8 Novembre 2001

2DE

Vantaggi

Svantaggi

Vantaggi

  • Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche (2.000–3.000 proteine)

  • Riproducibiltà e affidabilità dei risultati

  • Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti

  • Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine

  • fosforilazione

  • glicosilazione,

  • tagli proteolitici,

  • Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete

  • Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulare


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2DE : vantaggi vs svantaggi

2DE

Vantaggi

Svantaggi

Svantaggi

  • metodica lunga

  • molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, fatica fisica

  • bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche

  • difficile separazione delle proteine molto acide o basiche

  • scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kDa

  • bassa risoluzione delle proteine poco rappresentative nel campione proteico

  • mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gel

Vantaggi vs Svantaggi

Parma , 8 Novembre 2001


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