1 / 51

Cristal.lografia de Proteïnes per RX

Cristal.lografia de Proteïnes per RX. Marta Costa Guillem Galofré Meritxell Pellicer. Biologia Estructural UPF, 2004. SUMARI. INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT. SUMARI. INTRODUCCIÓ

jody
Download Presentation

Cristal.lografia de Proteïnes per RX

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Cristal.lografia de Proteïnes per RX Marta Costa Guillem Galofré Meritxell Pellicer Biologia Estructural UPF, 2004

  2. SUMARI INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT

  3. SUMARI INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT

  4. INTRODUCCIÓ Què és la Cristal·lografia de Proteïnes? • La determinació del mapa de densitat electrònica de la molècula s’obté de l’anàlisi del patró de difracció que experimenta un feix de Raigs X al atravessar el cristall. • Procés pel qual a través de la incidència de Raig X sobre un cristall de proteïna podem obtenir un mapa de densitat electrònica i a partir d’aquest trobar l’estructura de la proteïna.

  5. INTRODUCCIÓ Per què cristalls? • El cristall és una xarxa de molècules ordenades en la mateixa orientació repetida, això fa que les ones difractades es sumin i assoleixin prou intensitat. • Al ser irradiats produeixen un efecte de difracció que depèn de les distàncies entre els àtoms. • El patró de difracció està relacionat amb l’estructura de la proteïna.

  6. INTRODUCCIÓ Per què Raigs X? • Poden atravessar la matèria. • La seva longitud d’ona és tan petita com les distàncies interatòmiques, cosa que permet diferenciar i identificar els àtoms de la molècula.

  7. INTRODUCCIÓ El Sincrotró

  8. SUMARI INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT

  9. DIFRACCIÓ Interacció amb e- !!! S’ha d’amplificar la senyal de la radiació dispersada per a la seva detecció Suma d’amplituds Condició: sortir en fase!

  10. DIFRACCIÓ 1 cicle complert angle 2p 2p/ l (quantitat d’angle / distància recorreguda) l= longitud d’ona distància a d x Per regla de tres... q = x . (2p / l) q/ x

  11. DIFRACCIÓ q = (d . sina. 2p) / l • Perque surti en fase... • q = 2p a d x n2p = (d . sina. 2p) / l nl = d . sina q/ x • Tenint...q = x . (2p / l) • ...i... x = d . sina n *(n ha de ser nº sencer!)

  12. DIFRACCIÓ nl = d. sinq ...però cristall no és només 1 D... nl = r12.(S-S0) 3d q Difractat S Incident So h = a . ΔS k = b . ΔS LAUE! l = c . ΔS Nombres sencers! Condicions de Laue

  13. DIFRACCIÓ r ...per tant, qualsevol punt en l’espai de la cel.la podrà ser definit per un vector posició r: r = x a + y b + z c ...i recordant a Laue... r.ΔS = x h + y k + z l (...que són nombres sencers i més endavant veurem que ens serveix en les fórmules...) a = (a,0,0) b = (0,b,0) c = (0,0,c) Gràcies a les Condicions de Laue,definim la forma i dimensió de la cel.la que permetrà la difracció!

  14. DIFRACCIÓ Espai Recíproc i Esfera d’Ewald A nivell experimental, el que nosaltres observem és l’espai recíproc i no el directe: Mapa de Dispersió

  15. DIFRACCIÓ L’esfera d’Ewald com a model matemàtic, ens ajuda a entendre-ho... (a*,b*,c*) és l’espai recíproc de (a,b,c), siguent: a*= 1/a b*= 1/b c*= 1/c

  16. DIFRACCIÓ Funció de Dispersió! 1 2 3 , , ... *http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Basic_diffraction/data_animation.html

  17. SUMARI INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT

  18. The Twilight Zone... nl = d. sinq ? ? ? nl = d. sinq nl = d. sinq nl = d. sinq nl = d. sinq nl = d. sinq nl = d. sinq nl = d. sinq ? ? Entrem a la dimensió desconeguda...

  19. FUNCIÓ DE DISPERSIÓ -La suma de totes les dispersons de tots els e- ... ...per cada un dels punts en l’espai de la cel.la ... -...per la funció d’ona. Laue!!! A nosaltres el que ens interessa és la densitat electrònica!!! ...per tant, necessitarem l’ajuda de...

  20. FUNCIÓ DE DISPERSIÓ La Transformada de Fourier ens permet passar de l’espai “matemàtic” Fourier, a l’espai real, i viceversa. (En termes més senzills i pràctics; ens permet passar elements de la funció d’un costat a l’altre...) La Transformada de Fourier

  21. FUNCIÓ DE DISPERSIÓ

  22. FUNCIÓ DE DISPERSIÓ Transformada de Fourier + Part imaginària ...així: descomposem Part real (el que observem –mòdul-) Complex (a funció)

  23. SUMARI INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT

  24. PROBLEMA DE LES FASES aés un angle de desfase adicional... Que no coneixem!!! + Part imaginària Ens trobem amb el Problema de les Fases!!! Part real (el que observem –mòdul-) Complex (a funció) Per tant, apliquem a l’equació anterior, i...

  25. PROBLEMA DE LES FASES “El problema de les fases pot comparar-se a una orquestra en la que cada músic només rep la part de partitura que li toca interpretar. Un violoncel·lista sap quines notes tocar i amb quin ritme, però per coordinar el moment en què cada intèrpret ha de començar, existeix el mestre. Si aquest falta, no hi haurà coordinació i el resultat serà desastrós. D’aquesta manera, en les dades que el detector recull en la cristal·lografia falta saber “l’hora” en la que cada un entra, perquè la suma de les ones sigui el resultat real. És a dir, que la determinació de les fases de les ones informa de quan considerar cada una, i així sumar els pics i les valls.” COM RESOLDRE’L...?

  26. PROBLEMA DE LES FASES HI HA SOLUCIONS!

  27. SUMARI INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT

  28. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES • Determinació directa • Multiple Isomorphus Replacement (MIR) • Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD) • Molecular Replacement (MR) Però abans cal conèixer...

  29. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES ...l’empenta que ens dóna la Funció de Patterson: Ens ajuda, doncs ens dóna un valor real per F (F2 , relacionat amb la intensitat de les radiacions difractades captades) sense introduir-nos una fase desconeguda, eliminant així el problema de les fases. Obtenim: Fent la Transformada de Fourier, aïllarem la part de dins de l’equació que fa referència a la densitat electrònica!!! ... Però no és la densitat electrònica, sinó una Funció de Correlació, que ens estarà dient la distància entre dos centres electrònics. És un bon començament per aproximar-nos-hi...

  30. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES S’utilitza com a complement d’altres mètodes per resoldre les estructures protèiques. APLICACIONS ...Per tant, buscarem situar algun/s centre electrònic i, sabent la correlació de distàncies, ja podrem saber la posició de la resta, o sigui, el mapa de Densitat electrònica! Mapa de Patterson. És un mapa de vectors de les distàncies entre els centre electrònics. Mapa de Patterson bidimensional

  31. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES 1. Determinació directa Mètode directe que utilitza les relacions estadístiques entre els sistemes dels factors de dispersió per deduir els possibles valors de les fases. F OBSERVAT EXPERIMENTALMENT F HIPOTÈTIC • - molècules petites ( < 200 àtoms) • sub-estructures de macromolècules • últims desenvolupaments ( ~ 2000 àtoms) APLICACIONS

  32. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES • No necessiten derivats isomòrfs • No necessiten dispersors anòmals • No necessiten un model semblant • Poden completar tots els altres mètodes AVANTATGES INCONVENIENTS XDifraccions a molt alta resolució (1.2 Å o més) X A mesura que augmenta el nombre d’àtoms funcionen pitjor

  33. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES 2. REEMPLAÇAMENT ISOMÒRFIC MÚLTIPLE (MIR) Cristalls derivats de la proteïna a la qual se li han introduït alguns àtoms de metalls pesats. Patró de difracció de RX del cristall de la proteïna nativa i dels derivats. Aplicació de la funció de Patterson per determinar les coordenades dels àtoms pesats. Refinament dels paràmetres dels àtoms pesats i càlcul de les fases dels angles. Càlcul de la densitat electrònica de la proteïna nativa (aplicació de la transformada de Fourier un cop ja tenim les fases)

  34. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES La introducció d’un àtom pesat canvia significativament el mapa de dispersió. La contribució dels àtoms lleugers tendeix a anul·lar-se ja que dispersen en fases diferents; en canvi, els electrons d’un àtom pesat solen dispersar en la mateixa fase. Com a resultat, el canvi en la intensitat degut a l’addició d’un àtom pesat a la proteïna serà fàcilment mesurable. Com que la quantitat d’àtoms de metalls és reduïda podem obtenir el mapa de Patterson i per mètodes directes trobar les coordenades d’aquests metalls.

  35. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES Per poder solucionar el problema, la dispersió dels àtoms en la proteïna nativa no ha de variar per l’addició dels àtoms pesats,llavors les diferències en els patrons es deuran només a la incorporació dels nous àtoms. FPH = FP + FH Coneixem el mòdul i orientació d’un costat: FH; i el mòdul dels altres dos (FPH i FP). Com veiem hi ha dos possibles triangles, d’acord amb les dues possibles fases de FP.

  36. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES Construcció de Harker • Dibuixem un cercle de radi igual al mòdul de FP, centrat a l’origen; aquest cercle indica tots els vectors que es poden obtenir en totes les fases de FP (blau) • 2. Dibuixem un altre cercle de radi FPHcentrat a -FH (rosa) 3. Les interseccions entre els dos cercle són possibles valors de FP que satisfan l’equació FPH = FP + FH i estan en consonància amb els mòduls mesurats i amb el model de l’àtom pesat.

  37. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES • Llavors, si tracem un altre cercle a partir dels valors obtinguts amb un altre cristall derivat només una opció serà concordant amb totes les observacions. • Cal tenir en compte que en els segon cristall derivat canvies el metall però els has de situar en la mateixa posició. • Si la proteïna ja conté metalls es poden aprofitar i no n’has d’afegir tants. • Ja que es necessita més d’un cristall derivat, el mètode és anomenat Reemplaçament Isomòrfic Múltiple. • És el mètode més usat quan no tenim cap informació sobre l’estructura.

  38. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES 3. Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD) Variant del reemplaçament isomòrfic múltiple. Es basa en l’existència de metalls que al ser irradiats amb diverses longituds d’ona presenten un comportament diferent i, per tant, diferents Fs. D’aquesta manera ens estalviem haver de fer un segon derivat.

  39. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES 4. Molecular Replacement (MR) • Es basa en el coneixement previ de l’estructura tridimensional d’una altra proteïna homòloga cristal·litzada. • El model ha de posseir d’un 30 a un 50% de la seva seqüència d’aminoàcids idèntica a la que s’està analitzant. • Bancs de dades cristal·logràfiques PDB. • S’utilitza quan es disposa d’un bon model conegut que es correlaciona amb una fracció raonable de l’estructura del cristall de la proteïna problema.

  40. MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES Model Mapa densitats F F’ Mapa de densitats’ Rotació i translació Model’ METODOLOGIA 1- S’empra la estructura homòloga i es genera un mapa de densitat teòric. 2- Es produeix la superposició del mapa de densitat teòric amb l’observat. 3- Es minimitza la funció R-factor (funció de resolució), fent ús d’ una funció de rotació i translació.  ...

  41. SUMARI INTRODUCCIÓ DIFRACCIÓ FUNCIÓ DE DISPERSIÓ PROBLEMA DE LES FASES MÈTODES PER RESOLDRE EL PROBLEMA DE LES FASES REFINAMENT

  42. REFINAMENT Segueix un procés igual que el Reemplaçament molecular. Un cop s’obté el mapa de densitats de la proteïna problema, s’apliquen les funcions de rotació i de translació per tal de millorar-lo i ajustar-lo el màxim possible. Per ajustar-lo el màxim possible  H2O Fcalc nova R menor

  43. REFINAMENT REFINAMENT El model 3D al que s’arriba, pot deixar alguna part d’un aminoàcid fora de la densitat electrònica, i això exigeix un refinament.

  44. CONCLUSIONS Resumint... Aïllem la Proteïna Obtenim Cristall Irradiem Cristall Mapa de Dispersió Funció de Dispersió Transformada de Fourier (amb la funció de Patterson) Funció de Correlació (Mapa de Patterson) Mètodes + Refinament

  45. CONCLUSIONS AVANTATGES INCONVENIENTS • Permet determinar estructura 3D de compostos biològics • Alta exactitud i resolució estructural a nivell atòmic • No hi ha límit en la mida de la molècula X Grans quantitats de proteïna per purificar X Cristalls de molt bona qualitat X Possibles artefactes cristal·lins X Resultats a mitjà-llarg plaç

  46. BIBLIOGRAFIA • CANTOR, CR., 1998 Biophysical chemistry. Part II: Thecniques for the study of biological structure and function, New YorkCantor,WH Freeman and Co. • DRENTH, J., 1994, Principles of protein X ray crystallography, Nueva York, Springer-Verlag. • http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/course.html • http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html • http://www.ciencia-hoy.retina.ar/hoy60/luz.htm • http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_01.html • http:// info.main.conacyt.mx/secobi/bancos/cyd/pdf/133-38.pdf

  47. PEMs 1-     Quina de les següents afirmacions sobre la Cristal·lografia de proteïnes és correcta: a). La longitud d’ona dels raigs X utilitzats és més gran que les distàncies interatòmiques. b). Aquesta tècnica és la més emprada després de la Ressonància Magnètica Nuclear. c). Una de les avantatges del sincrotró és que permet escollir la longitud d’ona amb la que s’irradia el cristall. d). Perquè hi hagi difracció, a cada cel·la unitària només hi pot haver una molècula de la nostra proteïna. e). Totes les anteriors són falses. 2-     Pel que fa a la Cristal·lografia de proteïnes, quina de les següents afirmacions és correcta: a). Perquè es produeixi el fenòmen de la difracció no és necessari que les ones es dispersin en fase. b). En la següent expressió : n = d · sin , n pot ser qualsevol nombre real. c). El vector S0 fa referència a la radiació dispersada. d). Gràcies a les condicions de Laue, definim la forma i dimensió de la cel·la que permetrà la difracció. e). En les condicions de Laue no es té en compte la longitud d’ona de la radiació emprada.

  48. PEMs 3-Referent a la cristal·lografia de proteïnes per raigs X, quines de les següents afirmacions són falses : 1). A nivell experimental, les dades obtingudes fan referència a l’espai recíproc. 2). Aplicant la Transformada de Fourier a la Funció de Dispersió ja podem conéixer la densitat electrònica. 3). Per obtenir els diferents Mapes de Dispersió canviem l’angle d’incidència de la radiació respecte el cristall. 4). L’esfera d’Ewald és l’espai real que delimita el cristall.  a). 1,2,3 b). 1,3 c). 2,4 d). 4 e). 1,2,3,4 4-Què és el mapa de Patterson? a). És la representació en l’espai de la densitat electrònica de la nostra proteïna. b). S’utilitza en el procés de refinament. c). Les dues anteriors són correctes d). És un mapa de vectors de les distàncies entre els centres electrònics. e). Totes són correctes.

  49. PEMs 5-Quin dels següents no és un dels mètodes per resoldre el problema de les fases? a). Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD) b). Molecular Replacement (MR) c). Multiple Isomorphus Replacement (MIR) d). Molecular Multiwavelenght Replacement (MMR) e). Determinació directa 6-Quina o quines de les següents afirmacions sobre el Multiple Isomorphus Replacement (MIR) és falsa? 1). Requereix l’ús de metalls pesats. 2). Com a mínim cal l’obtenció de dos cristalls derivats diferents. 3). A l’inici, del factor d’estructura (vector) de la nostra proteïna i del derivat, només en coneixem el mòdul 4). Aquest mètode només es fa servir quan disposem d’informació sobre l’estructura de la proteïna. a). 1,2,3 b). 1,3 c). 2,4 d). 4 e). 1,2,3,4

  50. PEMs 7-Referent als mètodes per resoldre el problema de les fases: a). En el Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD) s’utilitzen metalls que donen lloc a patrons de difracció diferents depenent de la longitud d’ona amb la que han estat irradiats. b). Enel Molecular Replacement (MR) es busca maximitzar el valor de R mitjançant les funcions de rotació i translació. c). Les dues anteriors són falses. d). En el Multiwavelenght Anomalous Diffraction (MAD), com a mínim cal l’obtenció de dos cristalls derivats diferents. e). Totes les respostes són falses. 8-Pel que fa al procés de refinament, quins recursos podem utilitzar per millorar el model? a). Afegir molècules d’aigua. b). Fer una dinàmica restringida a la densitat electrònica. c). Les dues anteriors són correctes. d). Aplicar les funcions de rotació i translació. e). Totes les anteriors són correctes.

More Related