RNA 干扰文库及其应用

1. RNA干扰文库及其应用

2. RNAi的概况 • SiRNA类型 • RNAi文库（RNAi library) • RNAi文库的分类 • RNAi文库的构建策略 • RNAi文库在功能基因组研究中的应用 • RNAi library技术需要注意的问题

3. RNAi概况 • RNAi(RNA interference ，RNA干扰)：短双链RNA（dsRNA）诱导靶基因mRNA特异性降解，或阻止mRNA翻译，产生基因沉默（gene silence)的现象。因此，又称为knockdown。 • 1995年，康乃尔大学的Su Guo用反义RNA技术抑制par-1基因时，意外发现正义RNA（sense RNA）也能抑制C. elegans par-1基因表达。 • 1998年，Andrew Fire和Craig Mello揭示正义RNA抑制基因表达是由于混有双链RNA。

4. RNAi现象普遍存在动植物体内。发现植物中的21-25nt的RNA分子诱导PTGS（post-transciption gene silence，转录后基因沉默）。 • 2001年，Emily等在果蝇中确定了降解dsRNA的关键酶，并命名为Dicer，此酶属于RNaseIII家族，在进化上保守。

5. SiRNA的类型 • 寡核苷酸SiRNA：人工合成、体外转录 • 特点：易于设计、合成昂贵、瞬时表达 • 吗啡啉核苷SiRNA：人工合成RNA类似物。 • 特点：结合力强，不易降解，效率高 • 载体表达型SiRNA（细菌质粒、病毒载体）：基于表达载体在细胞内表达。 • 特点：稳定表达、可大量扩增，转染效率低，操作繁杂

6. RNAi的机制 • 细胞自然存在二种干扰RNA • siRNA（短干扰RNA）：19-25nt，由长dsRNA裂解而成的小片段，诱导mRNA降解。 • microRNA(miRNA) ：22nt，呈短发夹结构（short hairpin RNA，shRNA），由miRNA前体酶解而成，抑制mRNA翻译。

7. 线虫晚期miRNA的形成

8. 早期胚胎发育过程中miRNA参与细胞分化

9. 病毒或基因重组siRNA的形成及作用

10. RNAi 的基本过程： • siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量； • RISC（RNA-induced silencing complex）形成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量； • RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式； • 阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA，无需或消耗少量ATP。

12. RNAi library • 人工构建的一系列能对众多基因表达进行干扰的siRNA或shRNA文库。

13. RNAi library分类 • 已知基因RNAi library • 基因家族RNAi library • 信号通路RNAi library • 结构域RNAi library • 全基因组RNAi library • 随机序列RNAi library

14. RNAi library的构建策略 • 三种方案 • 化学合成 • 体外转录 • 体内生物合成（采用RNA转录载体）

15. （一）化学合成

16. （二）体外转录 • 体外转录合成siRNA • 以人工合成的寡DNA片段为模板 • 以cDNA基因为模板

17. （三）体内转录合成 • 用RNA转录载体（质粒、病毒载体）构建RNAi library • 通常采用Pol III启动子 U6或H1作为启动子 • Pol III启动子特点： • 总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA， • 遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。

18. （五）RNAi library的形式 • 双启动子互补形式 • 串联形式（tandem type） • 发夹形式（harpin type）

19. siRNA文库（双启动子互补）

22. （四）构建方法 1、根据靶基因序列，人工合成序列特异DNA片段插入到RNA表达载体 2、体外合成随机简并DNA片段插入到表达载体中 3、REGS（restriction enzyme generated siRNA)方法：cDNA片段文库两端接上限制性酶切位点，插入到表达载体中（常采用BsmB1、BspM1酶。 4、miRNA前体序列替换方法

23. shRNA文库（特异DNA序列法）

25. siRNA文库（随机序列法）

26. REGS法

30. miRNA前体序列替换方法

31. 发夹结构SiRNA的抑制效率比串联结构的SiRNA的效率更高发夹结构SiRNA的抑制效率比串联结构的SiRNA的效率更高 • 但发夹结构SiRNA存在二个严重的问题 • 一是更难设计发夹结构序列 • 二是有20-40%的发夹结构在细菌中会发生碱基突变

32. MIYAGISHI M and TAIRA K的研究结果

35. 如何确定作用靶序列 RNAi的特点： • SiRNA的效率取决于mRNA序列 • 随机SiRNA只有20-40%有较好的效果 • 对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。 • 多种因素会影响SiRNA的效率， • 有必要建立靶序列的运算法则

36. 设计原则： • GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 • 避免在5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs)设计siRNA • 选用靶基因特异且保守的序列 • SiRNA的特异性取决于靶序列的特异性，与其他同源基因超过3nt/21nt差异，就有较高的特异性。少于1nt/21nt差异，有非特异作用 • 设计阴性对照siRNA

38. RNAi library的应用 • 基因功能分析 • 胚胎发育与干细胞基因调控研究 • 细胞增殖与分化基因调控研究 • 细胞生长与转移基因调控 • 多基因疾病发病机制研究 • 表观遗传学分析（RNAi可诱导基因甲基化） • 信号通路新分子的筛选与鉴定 • 寻找新的药物靶标、基因治疗 • 药物作用机制探讨

41. 应用RNAi library技术需要注意的问题 • 了解各种RNAi library的优缺点 • 选择合适的研究对象和目标 • 建立准确、客观的生物体或细胞形态、结构、功能改变的判别指标，科学评判RNAi 的作用效率。 • 建立快速、灵敏、简便的检测方法：形态学、免疫学、生物化学等检测方法； • 建立高通量的研究技术平台