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RNA 干扰文库及其应用 PowerPoint PPT Presentation


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RNA 干扰文库及其应用. RNAi 的概况 SiRNA 类型 RNAi 文库( RNAi library) RNAi 文库的分类 RNAi 文库的构建策略 RNAi 文库在功能基因组研究中的应用 RNAi library 技术需要注意的问题. RNAi 概况. RNAi(RNA interference , RNA 干扰 ) :短双链 RNA ( dsRNA )诱导靶基因 mRNA 特异性降解,或阻止 mRNA 翻译,产生基因沉默( gene silence) 的现象。因此,又称为 knockdown 。

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RNA 干扰文库及其应用

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Presentation Transcript


Rna

RNA干扰文库及其应用


Rna

  • RNAi的概况

  • SiRNA类型

  • RNAi文库(RNAi library)

  • RNAi文库的分类

  • RNAi文库的构建策略

  • RNAi文库在功能基因组研究中的应用

  • RNAi library技术需要注意的问题


Rna

RNAi概况

  • RNAi(RNA interference ,RNA干扰):短双链RNA(dsRNA)诱导靶基因mRNA特异性降解,或阻止mRNA翻译,产生基因沉默(gene silence)的现象。因此,又称为knockdown。

  • 1995年,康乃尔大学的Su Guo用反义RNA技术抑制par-1基因时,意外发现正义RNA(sense RNA)也能抑制C. elegans par-1基因表达。

  • 1998年,Andrew Fire和Craig Mello揭示正义RNA抑制基因表达是由于混有双链RNA。


Rna

  • RNAi现象普遍存在动植物体内。发现植物中的21-25nt的RNA分子诱导PTGS(post-transciption gene silence,转录后基因沉默)。

  • 2001年,Emily等在果蝇中确定了降解dsRNA的关键酶,并命名为Dicer,此酶属于RNaseIII家族,在进化上保守。


Sirna

SiRNA的类型

  • 寡核苷酸SiRNA:人工合成、体外转录

  • 特点:易于设计、合成昂贵、瞬时表达

  • 吗啡啉核苷SiRNA:人工合成RNA类似物。

  • 特点:结合力强,不易降解,效率高

  • 载体表达型SiRNA(细菌质粒、病毒载体):基于表达载体在细胞内表达。

  • 特点:稳定表达、可大量扩增,转染效率低,操作繁杂


Rna

RNAi的机制

  • 细胞自然存在二种干扰RNA

  • siRNA(短干扰RNA):19-25nt,由长dsRNA裂解而成的小片段,诱导mRNA降解。

  • microRNA(miRNA) :22nt,呈短发夹结构(short hairpin RNA,shRNA),由miRNA前体酶解而成,抑制mRNA翻译。


Rna

线虫晚期miRNA的形成


Rna

早期胚胎发育过程中miRNA参与细胞分化


Rna

病毒或基因重组siRNA的形成及作用


Rna

RNAi 的基本过程:

  • siRNA形成:dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA,消耗能量;

  • RISC(RNA-induced silencing complex)形成:与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC,消耗ATP能量;

  • RISC 活化:siRNA解螺旋成单链,无活性的复合体转变成活性形式;

  • 阻止翻译或诱导mRNA降解:在siRNA引导下,RISC识别并切割互补的靶RNA,无需或消耗少量ATP。


Rnai library

RNAi library

  • 人工构建的一系列能对众多基因表达进行干扰的siRNA或shRNA文库。


Rnai library1

RNAi library分类

  • 已知基因RNAi library

  • 基因家族RNAi library

  • 信号通路RNAi library

  • 结构域RNAi library

  • 全基因组RNAi library

  • 随机序列RNAi library


Rnai library2

RNAi library的构建策略

  • 三种方案

  • 化学合成

  • 体外转录

  • 体内生物合成(采用RNA转录载体)


Rna

(一)化学合成


Rna

(二)体外转录

  • 体外转录合成siRNA

  • 以人工合成的寡DNA片段为模板

  • 以cDNA基因为模板


Rna

(三)体内转录合成

  • 用RNA转录载体(质粒、病毒载体)构建RNAi library

  • 通常采用Pol III启动子 U6或H1作为启动子

  • Pol III启动子特点:

  • 总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA,

  • 遇到4—5个连续的U即终止,非常精确。


Rnai library3

(五)RNAi library的形式

  • 双启动子互补形式

  • 串联形式(tandem type)

  • 发夹形式(harpin type)


Rna

siRNA文库(双启动子互补)


Rna

(四)构建方法

1、根据靶基因序列,人工合成序列特异DNA片段插入到RNA表达载体

2、体外合成随机简并DNA片段插入到表达载体中

3、REGS(restriction enzyme generated siRNA)方法:cDNA片段文库两端接上限制性酶切位点,插入到表达载体中(常采用BsmB1、BspM1酶。

4、miRNA前体序列替换方法


Rna

shRNA文库(特异DNA序列法)


Rna

siRNA文库(随机序列法)


Rna

REGS法


Rna

miRNA前体序列替换方法


Rna

  • 发夹结构SiRNA的抑制效率比串联结构的SiRNA的效率更高

  • 但发夹结构SiRNA存在二个严重的问题

  • 一是更难设计发夹结构序列

  • 二是有20-40%的发夹结构在细菌中会发生碱基突变


Rna

MIYAGISHI M and TAIRA K的研究结果


Rna

如何确定作用靶序列

RNAi的特点:

  • SiRNA的效率取决于mRNA序列

  • 随机SiRNA只有20-40%有较好的效果

  • 对哺乳动物细胞,最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA;而对非哺乳动物,比较有效的是长片段dsRNA。

  • 多种因素会影响SiRNA的效率,

  • 有必要建立靶序列的运算法则


Rna

设计原则:

  • GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

  • 避免在5'和3'端的非编码区(untranslated regions,UTRs)设计siRNA

  • 选用靶基因特异且保守的序列

  • SiRNA的特异性取决于靶序列的特异性,与其他同源基因超过3nt/21nt差异,就有较高的特异性。少于1nt/21nt差异,有非特异作用

  • 设计阴性对照siRNA


Rnai library4

RNAi library的应用

  • 基因功能分析

  • 胚胎发育与干细胞基因调控研究

  • 细胞增殖与分化基因调控研究

  • 细胞生长与转移基因调控

  • 多基因疾病发病机制研究

  • 表观遗传学分析(RNAi可诱导基因甲基化)

  • 信号通路新分子的筛选与鉴定

  • 寻找新的药物靶标、基因治疗

  • 药物作用机制探讨


Rnai library5

应用RNAi library技术需要注意的问题

  • 了解各种RNAi library的优缺点

  • 选择合适的研究对象和目标

  • 建立准确、客观的生物体或细胞形态、结构、功能改变的判别指标,科学评判RNAi 的作用效率。

  • 建立快速、灵敏、简便的检测方法:形态学、免疫学、生物化学等检测方法;

  • 建立高通量的研究技术平台


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