Hagn ting epr litr fsgreininga rna ranns knum
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 29

Hagnýting EPR litrófsgreininga í RNA rannsóknum PowerPoint PPT Presentation


  • 86 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Hagnýting EPR litrófsgreininga í RNA rannsóknum. Höfundur fyrirlestrar: Egill Skúlason 19. febrúar 2003 Háskóli Íslands Raunvísindadeild Efnafræðiskor Eðlisefnafræði 5. Helstu heimildir.

Download Presentation

Hagnýting EPR litrófsgreininga í RNA rannsóknum

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Hagn ting epr litr fsgreininga rna ranns knum

Hagnýting EPR litrófsgreininga í RNA rannsóknum

Höfundur fyrirlestrar: Egill Skúlason

19. febrúar 2003

Háskóli Íslands

Raunvísindadeild

Efnafræðiskor

Eðlisefnafræði 5


Helstu heimildir

Helstu heimildir

  • Í fræðilegri útlistun á EPR litrófsgreiningu notast ég bæði við bækur Atkins og Banwell en nýti mér einnig hina margrómuðu og verðlaunuðu heimasíðu Ágústar Kvarans.

  • Edwards, T.E., Okongi, T.M., Robinson, B.H., Sigurðsson, S.T. (2001). Site-Specific Incorporation of Nitroxide Spin-Labels into Internal Sites of the TAR RNA; Structure-Dependent Dynamics of RNA by EPR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. Vol 123, 1527-1528.

  • Edwards, T.E., Okonogi, T.M., Sigurðsson, S.T. (2002). Investigation of RNA-Protein and RNA-Metal Ion Interactions by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy: The HIV TAR-Tat Motif. Chemistry & Biology, Vol. 9, 699-706.


Innihald fyrirlestrar

Innihald fyrirlestrar

  • Undirstöðuatriði fræðanna á bak við EPR.

  • Rannsóknir á RNA.

  • Mikilvægi EPR í RNA rannsóknum.

  • „Spunamerkingar“ á RNA.

  • Viðfangsefni og aðferðir rannsóknanna sem greinarnar byggja á.

  • Niðurstöður rannsóknanna.


Epr esr

EPR = ESR

  • Flestar stöðugar sameindir haldast saman með tengjum þar sem rafeindaspunar eru paraðir. Undir þeim kringumstæðum er enginn „sýnilegur“ spuni, ekkert rafsegulvægi og því ekkert samspil á milli rafeindaspuna og segulsviðs.

  • Hins vegar eru til atóm og sameindir sem hafa eina eða fleiri rafeindir með óparaðan spuna og það eru þau tilfelli sem sýna rafspunamerki (Electron Spin Resonance eða ESR) í litrófsgreiningu.

  • Þar sem þessi fyrirbæri eru einnig meðseglandi eða paramagnitísk, þá er þessi tegund litrófsgreiningar oft nefnd Electron Paramagnetic Resonance eða EPR.


Epr litr fsgreinir

EPR litrófsgreinir

Algengast er að segulsviðið sé 0.3 T, sem þarf því 9 GHz eða 3 cm örbylgju til að merki fáist.


Fr i epr

Fræði EPR

  • Þegar óparaðar rafeindir eru til staðar í sameindum þá er spunastefna þeirra óregluleg.

  • Þegar sameindunum er komið fyrir í segulsviði þá stefna þessir „litlu seglar“ (sem rafeindaspuni er í raun og veru) í ákveðnar áttir.

  • Þar sem spunaskammtatala rafeinda er ½, þá er hægt að hugsa sér að hver þeirra snúist annað hvort réttsælis eða rangsælis um stefna segulsviðsins.

  • Aðeins tvær afstöður:

    2S+1 = 2*½ + 1 = 2 eða ms = S, S-1,...,-S = +½ og -½


Fr i epr1

Fræði EPR

  • Eðlisfræði EPR litrófsgreiningar er í megin dráttum sú sama og í NMR.

  • Orkuþrep rafeindaspuna í segulsviðinu B eru:

    Ems = gemBBmsms =  ½

    þar sem mB er Bohr segulvægiseining og ge = 2,0023

  • Þessi jafna sýnir að orka a e- (ms = + ½) eykst en b e- (ms = - ½) minnkar þegar styrkur segulsviðsins er aukinn, og bilið á milli orkuþrepanna er

    DE = Eb – Ea = gemBB

  • Ef sýnið örvast með rafsegulbylgju af tíðninni v, gildir:

    hv = gemBB


Orku st nd rafeindaspuna segulsvi i

Orkuástönd rafeindaspuna í segulsviði


Tlit epr r fa

Útlit EPR rófa

  • EPR róf eru í raun fyrsta afleiða eða hallatala af gleypni hvers punkts:

    dA/dB

  • Útslag toppa ræðst af styrk radikala eða paramagnetísks efnis í sýninu.

  • Breidd toppa ræðst af aförvunartíma spunaástandsins.


Hyperfine structure

Hyperfine structure

  • Orsök fyrir „hyperfine structure“ í EPR er víxlverkun á milli segla rafeindaspunans og segultvípólsvægis kjarnanna í radikalnum.

  • Radíkal með einn 14N kjarna (I = 1) og tvær jafngildar prótónur (I = ½) gæfi eftirfarandi „hyperfine structure“.


Rna ranns knir

RNA rannsóknir

  • RNA (Ribonucleic acid) eru langar sykurfosfatskeðjur þar sem mismunandi niturbasar (A, U, G eða C) tengjast hverjum ríbósa.

  • RNA getur hvatað efnahvörf og samverkað á sérstakan hátt með öðrum stórsameindum, eins og t.d. próteinum.

  • Til að skilja hlutverk RNA þarf að ákvarða þrívíða byggingu þess. Að lesa út úr kristalsgreiningu flókinna RNA sameinda getur reynst mjög erfitt.

  • Því hafa aðrar aðferðir verið notaðar til að ákvarða stöðu eininga í RNA secondary byggingu (helixa, lykkjur o.fl.) í þrívíðu rúmi.

  • Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) er hægt að nota til mæla langar fjarlægðir (35-85 Å).


Mikilv gi epr rna ranns knum

Mikilvægi EPR í RNA rannsóknum

  • Með því að „merkja“ ákveðna niturbasa í RNA sameindinni er hægt að rannsaka gang hvarfa, þrívíða byggingu og samspil RNA við t.d. prótein eða málmjónir með EPR.

  • Mælingar hafa verið gerðar með 8-25 Å vegalengd á milli tveggja óparaðra rafeinda.

  • „Merkingarnar“ eru framkvæmdar með ýmsum efnasmíðum þannig að „merkti“ hópurinn hafi staka rafeind.

  • Þannig fæst aðeins eitt merki, sem getur jú verið margklofið, en þannig er hægt á einfaldan hátt að túlka einstakar niðurstöður ef merkt er á mismunandi stöðum í RNA sameindinni.


Spuna merkingar rna

„Spuna merkingar“ á RNA

  • Nitroxíð spunamerki hefur verið innleitt í DNA annað hvort á niturbasa eða sykurfosfatskeðjuna.

  • Hins vegar eru einu aðferðirnar (2001) til að innleiða spunamerkið í RNA, á óparaðan uridine basa eða 5’-enda keðjunnar.

  • Aðferðirnar eru takmarkaðar því spunamerkið er ekki hægt að festa innvortis í basaparað tvístrennt RNA.

  • Margar sameindir hafa verið festar á 2´- kolefni hringsins í basapöruðum kjarnsýrum RNA.

  • Hægt er að nota 2’-amínó breytt RNA, sem hægt er að útbúa með því að nota ýmis algeng fosfóramíð.


Spuna merkingar rna1

„Spuna merkingar“ á RNA

  • Á þessari yfirlitsmynd er lýst hvernig festa má nitroxíð spunamerki á kolefni númer 2. Síðasta skrefið krefst DMF, formamide, borate buffer, pH 8.6, 90%


Tar rna

Tar RNA

  • Tar RNA er svæði í erfðaefni HIV sem í samvinnu við Tat prótein sér um umritun í eftirmyndunarferli HIV veirunnar.

  • TAR stendur fyrir Trans-Activation Responsive.

  • Fjögur spunamerkt Tar RNA voru útbúin, hvert þeirra með eitt spunamerki í stöðum U23, U25, U38 og U40.

    U = Uridine


Tar rna1

TAR RNA

A)TAR RNA

B)RNA sem vantar þriggja kirna lykkjuna sem er nauðsynleg fyrir Tat prótein bindingu.


Varmafr ilegar m lingar rna unum

Varmafræðilegar mælingar á RNA-unum

Niðurstöðurnar sýna að spunamerkingarnar hafa ekki mikil áhrif á secondary byggingu RNA


Epr litr f af spunamerktum tar rna um

EPR litróf af spunamerktum Tar RNA-um

  • U38 og U40 eru svipuð róf og ættu að gefa góða mynd af öðrum EPR mælingum í „venjulega“ basapöruðu Tar RNA.

  • Niðurstöðurnar sýna að það er takmörkuð hreyfing spunamerkisins, óháð kjarnsýrunni, sem er forsenda rannsókna í gangfræði.


Epr litr f af spunamerktum tar rna um1

EPR litróf af spunamerktum Tar RNA-um

  • U23 og U25 rófin sýna greinilega meiri hreyfanleika (~ 40-falt) en U38 og U40.

  • Í raun er hreyfanleiki U23 og U25 svipaður og hjá einstrendu RNA.


Samverkan rna vi pr tein og m lmj nir

Samverkan RNA við prótein og málmjónir

  • EPR litrófsgreining var notuð til að rannsaka breytingar í hreyfifræði spunamerktra kirna Tar RNA (U23, U25, U38 og U40) við bindingu á katjónum, argininamíði og tveimur peptíðum unnin úr Tat próteininu.


Epr litr f tar ca 2 og tar na 2 tengi

EPR litróf: TAR-Ca2+og TAR-Na2+ tengi

  • Svarta rófið er án málmjóna, blárauða með Ca2+ og það blágræna með Na+.

  • EPR litrófsgreing sýnir breytingu í hreyfanleika U23, U25, U38 og U40 í viðurvist Ca2+ og Na+ jóna.


Tar argininam tengi

Tar-argininamíð tengi

  • NMR greining á HIV-2 Tar RNA bundið við argininamíð hefur gefið vísbendingu um sérhæfða samverkan arginine 52 (R52) og Tar RNA í bindingu við Tat próteinið.

  • Niðurstöður úr EPR: Lítil minnkun í hreyfanleika niturbasa U23 og U38. Hreyfanleiki U40 minnkaði mun meira en hreyfanleiki U25 jókst hins vegar.


Hrif tat aflei a epr litr f tar rna

Áhrif Tat afleiða á EPR litróf Tar RNA


Tar tat tengi

Tar-Tat tengi

  • EPR róf voru tekin af þeim fjórum áðurgreindu Tar RNA-um í viðurvist bæði stökkbreyts (YKKKKRKKKKA) og náttúrulegrar gerðar (YGRKKRRQRRR) Tat-afleiddu peptíðanna.

  • Niðurstöður sýndu litla minnkun í hreyfanleika U23 og U38 en mun meiri minnkun hjá U40, í viðurvist stökkbreytta peptíðsins, á meðan hreyfanleiki U25 jókst.

  • Rófin fyrir U25 og U40 með náttúrulega peptíðinu eru svipuð og hjá því stökkbreytta á meðan mjög mikil lækkun er hjá U23 og U38.


Hrif tat aflei a epr litr f tar rna1

Áhrif Tat afleiða á EPR litróf Tar RNA


Magnbundin greining r epr

Magnbundin greining úr EPR


Magnbundin hrif katj na tar rna r epr

Magnbundin áhrif katjóna á Tar RNA úr EPR

  • Ca2+ og Na+ hafa svipuð áhrif á Tar RNA.

  • Hreyfanleiki U23, U25 og U38 minnkar á meðan U40 eykst.

  • Argininamíð og stökkbreytt Tat (sem hefur a.s. R52) hafa svipuð áhrif á Tar RNA en hreyfanleiki U23 og U38 minnkar margfallt meira hjá náttúrulega peptíðinu en hjá því stökkbreytta.

  • Þetta bendir til að fleiri amínósýrur en arginine 52 taki þátt í bindingu við Tar RNA-ið.


Ni urst ur dregnar saman

Niðurstöður dregnar saman

  • Nitroxíð spunamerki er hægt að innleiða á ákveðna staði í RNA.

  • Spunamerkingarnar hafa ekki áhrif á stöðugleika RNA.

  • Umhverfi spunamerktu kirnanna hafa greinileg áhrif á EPR merkin.

  • Ca2+ og Na+ hafa svipuð áhrif á hreifanleika kirnanna.

  • Amínósýran arginine (R52) sem er bæði í argininamíði og stökkbreytta Tat peptíðinu spilar lykilhlutverk í tengingu við Tar RNA.

  • Niðurstöður sýna að fleiri amínósýrur í náttúrulega peptíðinu hafa einnig áhrif á tengingu við Tar RNA.


  • Login