Download
1 / 25
280 likes | 559 Views
第二节 分子杂交及相关技术. 分子杂交 , 标记的探针 DNA 变性后与变性后的靶 DNA/RNA 通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程 。 分子杂交包括 ： DNA-DNA 杂交， DNA-RNA 杂交及蛋白杂交等。 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶 DNA 中同源的 DNA 片段。. 双链 probe 或 DNA 解链，主要取决于： 1 ． 链的长度 ：链越长，需要的 能量多才能解链； 2 ． 碱基成分 ： GC 含量高，较难变性； 3 ． 化学环境 ：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链. 一、杂交探针的获得.
E N D
第二节分子杂交及相关技术 分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程 。 分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。 分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。
双链probe或DNA解链，主要取决于： 1．链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链； 2．碱基成分：GC含量高，较难变性； 3．化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链
一、杂交探针的获得 • 是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。 • Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。
（一）制备特异性探针所需要的基本条件 1.被检基因结构清楚； 2.有明确的基因产物; 3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。
（二）特异探针的来源 • 1、基因组探针： • 从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。 • 克隆 • 扩增 • 大量的 • DNA探针
2、cDNA probe :从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。
3、寡核苷酸探针 根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约15～50个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。 克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。
二、探针的标记 • 将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。 • 常用于标记探针的标识物： • 同位素：32P, 35S, 3H-dNTP等； • 非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。 • 常用的标记方法：
1、缺口平移法 （Nick Translation） • 原理及过程： • 反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5’ → 3’外切酶活性，在缺口处按5’→ 3’方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5’ → 3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。
Nick Translation DNA 32P-dNTP Bio-dNTP dNTP ，DNA酶I，DNA聚合酶I p OH OH+ P P
2、随机引物法（6核苷酸引物标记法） • 原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→ 3’聚合酶活性。 • 被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3’端为起点，沿模板3’ → 5’方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。
随机引物标记探针 DNA Klenow,dNTP 变性-复姓 32p-dNTP,Bio-Dntp 6bp primer 3` 5` 5` 5` 3`
一、DNA杂交常用的方法 （一）.Southern blot 1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。 1、原理和步骤: 提取T 、Cell DNA 限制酶消化 DNA片段 电泳分离 变性转移至尼龙膜 变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析
2、应 用: (1)基因组结构分析： 如缺失、插入、倒位等的检测 (2)RFLP连锁分析
(二).斑点杂交(dot and slot hybridization) 鉴定核酸序列的简便方法。 1、原理及步骤：提取T、Cell DNA ↓ 点样品至膜、干燥、固定 ↓ 探针、DNA变性、杂交 ↓ 洗膜、放射自显影 ↓ 结果分析
DNA样品 点样 Probe-32P 检测 2、应用： 1）混合样品DNA鉴定 2）基因缺失检测 3）基因表达分析 A B 1 2 3 4
（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASO）（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASO） • 该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交检测。 • 检测点突变时一般需合成两种探针： 设计：正常探针 5’-AGT-3’与正常基因序列杂交 稳定而不与突变基因杂交； 突变探针 5’-AAT-3’与突变基因序列杂交 稳定而不与正常基因杂交； • PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后的产物——突变基因检测。
例:PKU产前诊断 Ⅰ 1 2 Ⅱ 1 2 正常探针 突变探针 Ⅱ2进行产前基因诊断 结果分析Ⅱ2为正常个体
四、Northern blot • 是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基 • 因探针分析基因的转录水平。 1、原理及步骤：提取 T、Cell 总 RNA ↓ 提纯分离mRNA ↓ 琼脂糖凝胶电泳分离RNA ↓ 转移至硝酸纤维素膜 ↓ 杂交检测
2、应 用： • （1）.检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）； • （2）.mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）
五、Western blot 是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。 原理及步骤： T or cell ↓ 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白 （SDS-PAGE ）↓ 转移（印迹）于硝酸纤维素膜 ↓ • 加抗体检测某种特异性蛋白质
