ایدز،ایمنی و پایش درمان

1. ایدز،ایمنی و پایش درمان تدوين و گردآوري: آزمايشگاه مرجع سلامت اسفند ماه 1392

2. ايدز یا سندرم نقص ایمنی اکتسابی نوعی بيماري است كه در دستگاه ایمنی و توسط ويروس HIVايجاد مي شود. تاكنون فرضيه های متعددي براي توضيح چگونگي پيدايش این بيماري شكل گرفته است.ديده شده كه ميمون هاي سبز آفريقايي با ويروس هايي كه بسيار شبيهبهHIV هستند مبتلا مي شوند اما بيمار نخواهند شد.گمان ميرود كه نوعي جهش در يكي ازاين ويروسها منجر به پيدايش HIV شده و احتمالا از طريق تروما به انسانها انتقال يافته است، لذا HIVهيچ مخزن شناخته شده انساني ندارد.

3. انواع HIV ويروس HIVاز رترو ويروس هاي حيواني است كه بر دو نوع اصلی می باشد: : HIV1شايع ترين عامل ايدز است و چندين زيرگروه دارد.بيش از90% افراد آلوده به HIV1در كشورهاي در حال توسعه زندگي مي كنند.روش انتقال در 80% موارد از راه جنسي مي باشد و از زمانيكه اولين مورد ابتلا به ايدز در سال 1981 درآمريكا(درمعتادان تزريقي وهمجنس گرايان مشاهده شد)گزارش گرديد تا به امروز بيش از 25ميليون نفر در اثر ابتلا به اين بيماري از دنيا رفته اند. :HIV2 درآفريقاي غربي اندميك بوده و ازنظر آنتي ژنیيسيته با HIV1متفاوت است. قدرت بيماري زايي كمتري داشته و نوعي از ايدز با پيشرفت آهسته تري ايجاد ميكند.

4. راه انتقال ويروس به انسان: • استفاده ازسوزن وسرسرنگ مشترك وياتجهيزات مورداستفاده براي تزريق • رابطه جنسي بافرد آلوده به ويروس • متولد شدن از مادر مبتلا به ايدز: اين ويروس در دوران بارداري،موقع تولد نوزاد وياشيردهي ميتواند ازمادر به فرزند منتقل شود. • دريافت خون وفراورده هاي خوني وياپيوند اعضاازفردي كه مبتلا به اين ويروس مي باشد. • از طريق تزريق غيربهداشتي وشيوه هاي دندان پزشكي • غذايي كه فرد مبتلا به HIV جويده است واز دهان خود بيرون آورده است .اين مورد بيشتر در مراقبان كودكان مبتلا به HIV ديده شده است. • گازگرفتن توسط فرد مبتلا كه باعث زخمي شدن وتخريب بافت وخون آمدن شود. • تماس باپوست زخمي ،جراحت ويا خلط بيمار مبتلا به ايدز

5. اگر لب ولثه بيمارخوني باشد وشمارا ببوسد. • خالكوبي باوسايل غيراستريل ازچه طريق منتقل نمي شود: • آب وهوا • گزش حشرات ازقبيل پشه • بزاق ،اشك وياعرق بدن • دست دادن به بيمارويااستفاده مشترك از ظرف غذا

6. وضعيت بيماري ايدز در ايران: اولين مورد ايدز در ايران در سال 1366 در يك پسر بچه 6 ساله مبتلابه هموفيلي شناخته و گزارش شده(ازتعداد2000 بيماري كه فاكتور 8 و 9 وارداتي رادريافت كرده بودند، آزمايش ايدزبه عمل آمد كه 15% اين افراد آلوده به ويروس بودند) و تا سال 1375 مواردی به صورت پراكنده در مصرف كنندگان داروهاي مشتق از خون وارداتي و افرادي كه در خارج از كشور اقامت طولاني داشته اند گزارش مي شد. در سال 1375 اولين همه گيري HIVدر يكي از زندان ها مشاهده شد وبه سرعت در بين جمعيت مصرف كنندگان مواد مخدر تزريقي در تمام كشور گسترش يافت. ميتوان گفت كه در حال حاظر كشور در وضعيت بحراني قرار گرفته و خطر گسترش آلودگي به توده مردم وجود دارد.

7. بايد خاطرنشان كرد يرخي از بيماراني كه اكنون به مداواي ايدز نياز دارند قبل از كشف HIV و اتخاذ معيارهاي بهداشتي عمومي براي پيشگيري از ايدز به آن مبتلا شده اند. از اين رو پيش بيني سير آتي بيماري به دليل فقدان اطلاعات درباره مبتلاياني كه در سالهاي آينده براي دريافت خدمات پزشكي مراجعه خواهند كرد بهدرستي امكان پذير نيست. بنابراين تا هنگام مراجعه اين بيماران هيچگونه آمار دموگرافيك درباره آنها در دسترس نخواهدبود .اين تاخير باعث ميشود اتخاذ راهكارهاي بهداشتي عمومي براي مقابله با ايدز در مقايسه با نحوه برخورد با ساير عوامل بيماري زا پيچيده ترگردد.

8. ساختار و چرخه زندگي ويروس: ويروس HIV يك رترو ويروس پوشش دار است.ژنوم آن از دو نسخه RNAتك رشته اي تشكيل يافته و توسط غشاي سلول ميزبان كه داراي پروتئين هاي ويروسي می باشد احاطه شده است . این ویروس انواع مختلفي از سلول هايCD4+ شامل منوسيت ها، ماكروفاژها ،دندرتيك سل ها وميكروگليان هاي مغز را آلوده ميكند.به سبب آن كه آنتي ژن CD4 گيرنده اصلي جهت ورودويروس به داخل سلول میباشد و اين ماركر بر روي سلول هاي فوق وجود دارد، عفونت سلول ها با HIV با اتصال گليكوپروتئين پوششي ويروس(env)به CD4 و گيرنده هاي گلوكاين به عنوان گيرنده هاي كمكي آغاز ميشود.

9. سلول هاي+CD4 به دليل داشتن نقش بنيادين در هماهنگ ساختن پاسخ ايمني سلولي یکی از اجزاي حياتي اين پاسخ راتشكيل مي دهد.نقايص كمي و كيفي در اين سلول ها منجر به بروز انواعي از اشكالات ايمني همچون كاهش واكنش هاي مختلف لنفوسيتي ،كاهش پاسخ گويي در برابر آنتي ژن هاي محلول، اختلال توليد لنفوكاين ها، كاهش سايتوتوكسيسيته اختصاصي ،كاهش ايمني طبيعي ،فعال سازي پلي كلونال سلول هاي B ،اختلال در سنتز ايمنوگلوبولين هاي اختصاصي و كاهش مرگ پاتوژن هاي درون سلولي ميگردد.

11. بر سیستم ایمنی HIVاثر به طوركلي دستگاه ایمنی به دو نوع ذاتي و اكتسابي تقسيم میشود: ايمني ذاتي (طبیعی): شامل آن دسته از پاسخ هاي ايمني غيراختصاصي ميباشد كه بدون برخورد با آنتي ژن معين فعال مي شود ازقبيل فعال سازي كمپلمان وفعاليتهاي سلول هاي كشنده طبيعي. ايمنياکتسابی (اختصاصی): شامل آن دسته از پاسخ هاي اختصاصي ميباشد كه در مواجهه با آنتي ژن معين فعال ميشود ودر قالب دو سيستم ايمني همورال و ایمنی سلولی بروز میابد.

12. HIVباعث آسيب عملكردي هر دو سيستم ايمني اكتسابي و ذاتي ميشود. از جمله نقص هاي ايمني اکتسابی كاهش تعداد سلول هاي TCD4 +به خصوص در مرحله حاد عفونت است كه به علت اثرسايتوپاتيك مستقيم ويروس بر روي سلول است. سير بيماري HIVميتواند توسط اندازه گيري ميزان ويروس در پلاسماي بيمار و توسط شمارش سلول هاي TCD4+ مشخص گردد.

13. در اثر كاهش سلول هاي T CD4+ خون به زير 200 عدد در ميكروليتر ويا كاهش نسبت سلول هايCD4+ به كل لنفوسيت ها به كمتر از 14% ، افزايش شديد ويرمي در سلول هاي مخزن غير از سلول هاي T دارد. البته علاوه بر تعداد سلول هاي CD4+ شاخص هاي جايگزين ديگري مانند میزان B2ميكروگلوبولينو نئوپترين نيز در تعيين پيش اگهي بيماري ارزشمند است.

14. درمان عفونت HIV درمان کنونی شامل تجويز سه گروه از داروهاي ضد ويروسي است كه به صورت تركيبي به كار ميروند و مولكول هاي ويروسي را هدف قرار ميدهند اين درمان دارويي سه تايي جديد ) HAART كه شامل مهار کننده نوکلئوزیدی ترانس کریپتاز [NRTIs] به علاوه یک مهار کننده پروتئاز [PI] و یا یک مهار کننده ترانس کریپتاز معکوس [NNRTI] است به عنوان مثال البيتگراوير+ كبيكيستات+ تنوفووير/ امتريسيتابين)ناميده ميشودو به صورت موثري باعث كاهش RNAويروسي در پلاسما تاحد سطوح غير قابل اندازه گيري در اكثر بيماران تحت درمان براي بيش از سه سال ميشود.(به گزارش اسوشيتدپرس ،شركت مرك آلمان سازنده داروي جديد بانام ‍‍ژنريك raltegravir توسط شخصي به نام Isentress مي باشد.خصوصيت بارز اين دارو اين است كه برروي آنزيم اينتگراز HIV تاثير گذاربوده كه داروهاي قبلي فاقد اين خصوصيت بوده اند.)

15. HIVروش هاي تشخيص ا- روش الايزا(تايين تيتر آنتي بادي عليه HIV)2-كيت rapid test براي غربالگري بيماران ايدزي از سالم3-روش فلوسايتومتري( كمك به تشخيص و پايشدرمان)

16. فلوسايتومتري استفاده باليني از فلوسايتومتري در نيمه دوم دهه 1970 آغاز شد. شايع ترين درخواست باليني استفاده از فلوسايتومتري، انجام شمارش سلول هاي CD8+و+ CD4درخون محيطي بيماران HIV +جهت تعيين درجه وپايش متوالي آن ازديگر كاربرد هاي تحقيقاتي مطالعه پلاكت ها براي رديابي آنتي بادي هاي ضد پلاكتي در بيماري هاي خودايمني وتعيين فعاليت پلاكت هايي است كه در زمان برخورد خون با پروتزهاي عروقي يا سطح وسايل پزشكي دستخوش تغيير ميگردند.

17. سيستم فلوئيديك فلوسايتومتر اجزاي متعدد سلول را تعيين و هم زمان مورد شمارش قرار مي دهد . اين سيستم با تنظيم فشار هوا از عملكرد پايدار جريان هريك از خطوط نمونه و Sheath رسيده به فلوسل اطمينان حاصل مي كند.با ورود نمونه به محفظه فلوسل حركت سريعتر مايع sheath بيروني فلوسل باعث مي شود محلول sheath به صورت هيدروديناميكي فوكوس گشته و تنها ذرات منفردي از آن در مقابل ناحيه باريكي مقابل پرتو ليزر قرار گيرند.در رايج ترين حالت پرتو نوري يك يا چند ليزر با هر ذره برخورد كرده و سيستم ميزان وجهت نور پراكنده شده را كه معياري از اندازه شكل و ساختمان ذرات پراكنده ميباشد اندازه گيري مي نمايد.

18. حال اگر ذرات با يك يا چند رنگ فلوئورسنت كه تحت عنوان فلوروكروم شناخته ميشوند رنگ آميزي شوند منبع نوري با برانگيخته كردن اين مواد اطلاعات بيولوژيكي اضافه اي درباره هر ذره مانند حضور ماركرهاي سطحي خاصي را فراهم مي نمايد.مزيت منحصر به فرد فلوسايتومتري اين است كه ميتواند پارامترهاي چندگانه اي را به طور همزمان به سرعت و به صورت كمي بر روي تك تك سلو لها،هريك به طور منحصربه فرد اندازه گيري كند.

20. به طور كلي ميتوان كاربرد هاي پزشكي فلوسايتومتري را در 4 مورد خلاصه كرد: 1-تشخيص و طبقه بندي سرطان هاي خون 2-تشخيص فاكتورهاي بيولوژيكي و حضور برخي ملكول هاي اختصاصي كه در تعيين پيش اگهي بيماري نقش دارند 3-شناسايي آنتي ژن هايي كه به عنوان هدف هاي درماني استفاده ميشود. 4-شناسايي سلول هاي باقيمانده بدخيم در طول درمان كه در تعيين پاسخ به درمان واحتمال

22. PARTEC CYFLOW COUNTETRاجزا و فيلترهاي اين دستگاه با سه پارامتر نوري مجهز گرديده كه از اين سه پارامتربراي آشكارسازي پرتوهاي نوري SSC (نور پراكنده شده سمتي) و همچنين فلوئورسانس نارنجي (FL2) وفلوئورسانس قرمز(FL3)استفاده ميشود. اين پرتوها تحت زاويه 90درجه نسبت به ليزر جمع آوري شده و سپس در هركانال توسط فيلترهاي اپتيكي به طول موج هاي مختلف تقسيم ميگردند.

25. 1-پردازش سيگنال فتو مالتي پلير طول موج هاي مختلف توليد شده در مرحله قبل را جمع اوري نموده وتوليد يك پالس الكتريكي مي نمايد وسپس پالس الكتريكي ايجادشده توسط پردازشگر الكترونيك پردازش ميگردد .2-فيلتر اپتيكي:يك فيلتر اپتيكي تنها اجازه عبور طول موج هاي معيني را داده و ساير طول موجها راجذب ميكند 3-نمايش اندازه گيري داده ها را ميتوان هم به صورت هيستوگرام تك پارامتري (CD4) و هم به صورت نمودار نقطه اي (CD4%) نمايش داد.

26. Histograme showing human mononuclear cells incubated with anti-CD4

28. 4- Gain(بهره): بهره معياري از تقويت يك سيگنال است. 5-Regions and Gates :Regions براي تعريف و تعيين يك جمعيت سلولي معين ترسيم مي شوند .در هيستوگرام هاي يك بعدي براي ترسيم Region از range ودر نمودارهاي دو بعدي از polygon استفاده مي شود.6-fluorescence staining : اغلب براي داشتن اطلاعات بيشتر از سلولها بايد انها را با يك ماركر فلوئورسانس نشان داركرد.لكوسيت ها را به دليل داشتن CDماركرهايشان به زيرجمعيت هايشان تقسيم نمود.

29. نكات قابل توجه قبل از كار با cyflow counter 1-محلول هايپكلرايت (محلول سفيد) براي رفع گرفتگي دستگاه است.2-بهتر است ايزوتون sheathرا هر دو يا سه هفته بعد از كاربا دستگاه دور بريزيم.3-درب (قرمز رنگ) waste بايد محكم بسته شود تا دستگاه بتواند خلا ايجاد كند.4- در ظرف waste بايد مقداري وايتكس بريزيم تا آلودگي به HIV از بين برود5-نمونه استفاده شده براي ازمايش خون حاوي ضدانعقاد EDTA موجود در ويا ل CBCاست.6-بهتر است خون استفاده شده تازه باشد و اگر مكان نمونه گيري دور از آزمايشكاه است تا حداكثر 48 ساعت به ازمايشگاه ارسال شود.7- به طور تجربي مشاهده شده مقادير آزمايش شده بعد از 24 ساعت +-10% تفاوت با مقادير اوليه دارد.

30. Cyflowcounter روشن و آماده كردن دستگاه 1) ابتدا كليد برق اصلي واقع در پشت دستگاه را روشن نموده سپس كليد سبز رنگ واقع شده در سمت چپ لوگوي پارتك كه در جلوي دستگاه واقع گرديده را فشار دهيد. 2) استفاده از نرم افزار Cyview این نرم افزار به طور اتوماتيك پس از روشن نمودن كامپيوتر اجرا مي گردد. 3) شستشويك لوله حاوي 1/6 ميلي ليتر محلول شستشوي پارتك (كدپارتك4009-04) را بهصورت پورت نمونه وارد نماييد. استارت را براي شروع اندازه گيري كليك كرده و تا زماني كه اندازه گيري و پروسه شستشوي بعد از ان به طور اتوماتيك متوقف مي شود منتظر بمانيد.

31. فرايند فوق را با 1/6 ميلي ليتر مايع sheathبراي حذف محلول هاي شستشوي ته مانده تكرار نماييد. كنترل كيفيت دروني دستگاه بطري حاوي بيدهاي سبز را 2دقيقه تكان داده سپس 850 ميكرون ( لاندا ) از آن رادر لوله نمونه ريخته و آن را در پورت نمونه دستگاه قرار داده و استارت را براي شروع اندازه گيري كليك نماييد وتا زماني كه اندازه گيري و پروسه شستشويپس از ان متوقف میشود منتظر بمانید سپس داده ها را در صورت نياز ذخيره سازي و يا چاپ نماييد. داده هاي فوق را با اندازه هاي موجود بر روي برچسب بطري بيد مقايسه كنيد. اگر تفاوت به ميزان 10% ± باشد دستگاه براي آناليز هاي بعدي آماده است.

32. شمارش CD4 به دو روش زير صورت ميگيرد: 1) 20 لاندا از خون بيمار + 20 لاندا آنتي بادي واقع در كيت مورد استفاده راكاملا mix كرده و 15 دقيقه در دماي اتاق و در جاي تاريك انكوبه مي نماييم.بلافاصله بعد از گذشت زمان انكوبه، 800 لاندا بافر اضافه نموده و با دستگاه ميخوانيم. 2) 20 لاندا خون بيمار را در تيوپ هايي كه آنتي بادي قبلا در آن DRY شده مي ريزيم و به مدت 15 دقيقه در دماي اتاق و در جاي تاريك انكوبه مي نماييم .سپس 800 لاندا محلول بافر را در تيوپ ريخته بلافاصله براي خواندن به دستگاه مي دهيم.

33. محاسبه درصد CD4 (CD4%) در كيت مورد استفاده آنتي بادي در تيوپ درب زرد رنگ به صورت DRYاست. 20 لاندا خون تام را در تيوپ فوق ريخته ، 15 دقيقه در دماي اتاق و در جاي تاريك انكوبه میكنيم (نكته قابل توجه :هر 5 دقيقه تيوپ راshake مي كنيم) بعد از گذشت زمان 15 دقيقه، ابتدابافر موجود در تيوپ درب نارنجي و سپس بافر موجود درتیوپ درب مشكي را در تيوپ درب زرد ريخته و آن را به دستگاه مي دهيم.

34. مراحل نرم افزاري طي شده بعد از دادن نمونه ها به دستگاه: بعد از دادن نمونه از گزينه استارت براي شروع اندازه گيري استفاده مي كنيم.براي بارگذاري script متناظرو براي اندازه گيريت مطلق تعداد CD4واندازه گیریCD4% به روش زير عمل مي كنيم.scrOr CD4% Load script → CD4 scr→ setting

35. در اندازه گيري مطلقCD4 مي توان محل پيك هيستوگرام را با تغييرمقدار بهره (gain)درحين اندازه گيري تعيين نمود. افزايش بهره ،پيك ها را به سمت راست و كاهش آن، پيك ها را به سمت چپ جا به جا ميكند.در بيشتر مواقع با تغيير مقدار بهره و سيگنال ها ،پيك ها را در يك هيستوگرام بهينه مي كنند.ضمنا بايد دقت كرد در طول انجام يك شمارش كه با نوار سبز رنگ سمت راست نشان داده مي شود هيچ يك از پارامترهاي سرعت،بهره و L-Lنرم افزار را تغيير ندهيم.همچنين بايد تا زماني كه اندازه گيري و فرايند شستشوي پس از آن به طور اتوماتيك متوقف نشده منتظر بمانيم. درطي اين فرايند Flushدر سمت راست نمايش داده مي شود. در انتها نمايش اندازه گيري بر حسب سلول بر ميكروليتر در پنجره resultنشان داده شده در پنجره particles تعداد مطلق جمعيت سلولي آناليز شده در حجم 200ميكروليتر نمايش داده ميشوند.

36. مشخصات منوي پايين صفحه نمايش: منوي پايين صفحه نمايش شامل توابع و اطلاعات زير ميباشد:Start : زماني كه نمونه به دستگاه داده شود از اين گزينه براي شروع اندازه گيري استفاده ميشود .Break: زماني كه بخواهيم يك اندازه گيري معين را در يك مرحله خاص قطع كنيم لز اين گزينه استفاده ميشود.فرايند اندازه گيري را ميتوان در زمان ديگري ادامه داد.Cancel: براي لغو فوري اندازه گيري در حال انجام لز اين گزينه استفاده ميشود.Bottles: سطح بالاي بطري هاي حاوي sheath و wasteرا نشان ميدهد. رنگ قرمز نشان دهنده اين است كه يا بطري sheath خالي از محلول و يا بطري waste پر مي باشد.

37. flow: مقادير sheathبر حسب ميكروليتر بر وجريان نمونه بر حسب ذره بر ثانيهبه طور طورمتناوب نشان ميدهد.Clean :با كليك كردن اين گزينه يك چرخه شستشوي دروني فعال ميگردد.Data :ظرفيت حافظه براي هر اندازه گيري را نمايش ميدهد.Clear :با كليك نمودن اين گزينه داده ها را از نمودارهاي نقطه اي و هيستوگرام محو خواهيم نمود.Smpl :سطح بالايي محتواي لوله نمونه را نمايش ميدهد.رنگ سبز نشان دهنده پربودن لوله نمونه و رنگ قرمز نشانگر خالي بودن ان ميباشد.تركيب رنگ سبز و قرمز نشان دهنده اين است كه سطح نمونه بين دوالكترود مي باشدبنابراين نبايد در هيچ بك از تنظيمات دستگاه تغييري ايجاد كرد.

38. روند خاموش كردن و شستشوي روزانه: 1) 1/6 ميلي ليتر محلول گندزدا را در تيوپ نمونه ريخته و آن را به پورت نمونه وصل واستارت را كليك کرده و تا زماني كه فازPRERUNپايان يابد منتظرمانده وسپس سرعت را به 20 افزايش دهيد. همچنين تا زماني كه اندازه گيري و فرايند شستشوي پس از آن به طور اتوماتيك متوقف مي شود.2) مرحله فوق را با 1/6 ميلي ليتر محلول شستشو تكرار كنيد.3) 1/6 ميلي ليتر مايع شيث را در تيوپ نمونه ريخته و آن را به پورت نمونه وصل نموده واستارت را كليك نموده و تا زماني كه فاز PRERUN پايان يابد منتظر بمانيد و سپس سرعت را به 20 افزايش دهيد. پس از يك دقيقه از انجام اندازه گيري، stop را كليك مي كنيم. 4) 10تا 20 ميلي ليتر محلول هايپوكلرايت را به بطري waste اضافه نموده و آن را به مدت 15 دقيقه قبل از دور ريختن waste انکوبه نمائید. 5) دستگاه را خاموش نماييد.