תעלות

1. תעלות

3. Fig. 1: “From Neuron to Brain”, Chapter 11, by J.G. Nicholls, A.R. Martin, B.G. Wallace and P.A. Fuchs (2001).

4. AMPAR Fast kinetics Fig. 9D from Tour, O., Parnas, H. and Parnas, I. (1998). Biophysical Journal.

5. NMDAR Slow kinetics Fig. 3 from Lester et. al, (1990), Letters to Nature

6. TRPL • שינוי ב: • מוליכות • הסתברות הפתיחה • משך הפתיחה • open channel block

7. Fig. 3 from Gibb and Colquhoun (1992), J. Physiol. Single channel currents activated by 30 nM-glutamate and 1mM-glycine in EDTA-buffered “zero divalents” solution. From an inside-out patch clamped at –60mV. Channel openings (downwards) occur in bursts and clusters of bursts. Successive horizontal traces show twelve continuous 500 msec sweeps to demonstrate the pattern of channel activation seen at these low glutamate concentrations. Currents were low-pass filtered at 2 kHz (-3 dB).

8. חוקי מרקוב • המעבר ממצב למצב צריך להיות הסתברותי • ההסתברות לעבור ממצב למצב אינה תלויה בזמן • ההסתברות לעבור ממצב למצב אינה תלויה בהיסטוריה

9. 2k1 k1 ko R + G GR + G O k-1 2k-1 kc NMDAR simplified kinetic model G2R

10. המצבים בהם נמצאת התעלה burst ומחוצה לו

12. “open time histogram”, Fig.2 from D. Colquhoum and A.G. Hawkes in “Single-Channel Recording, Ed. B. Sakmann and E. Neher.

18. k1 k2 GR + G G2R O kn Channel State 2k-1 kc במקרה שלנו ko k1 באופן כללי

19. kO kB B C O kC k-B • תעלה זו מראה Burst behavior בין ה- O state וה- B state. • הכניסה ל-B מקצרת את הפתיחות. • ברור שיש פתיחות שלא עוברות ל- B. • המשך הממוצע של פתיחות אלה צריך להיות 1/kC. • לכן נראה שני אקספוננטים במקרה זה. נכון/לא נכון? לא נכון!

26. מספר התעלות ב- patch

27. מספר התעלות ב- patch • Suppose N independent channels • The probability that r of those channels are open simultaneously should be given by the binomial distribution Po – the probability of an individual channel is open

28. מספר התעלות ב- patch • How to estimate N? • The largest number of simultaneously open channels – very crude! • Other methods such as maximum likelihood estimation are equally bad. • When Po is low the problem can’t be solved. • But how to estimate Po from a unknown number of channels

29. מספר התעלות ב- patch • Evidence for the presence of only one channel • if the Po is very high – and no double openings are seen. Horn (1991) according to binomial simulations If 50% of the time (or more) the channel is open there is only one channel.

30. מספר התעלות ב- patch • Evidence for the presence of only one channel • A simple approximation no single openings Po is low Two state model with α – close rate, β – open rate β C O α

31. מספר התעלות ב- patch • Denote: mo- mean open time ms – mean shut time N- The actual number of channelsπ- if one of the channels is open, the probability that the next transition is shutting of this channel rather then a second channel is open X

32. מספר התעלות ב- patch Observed probability

33. מספר התעלות ב- patch How many consecutive single openings are likely to be seen when there are actually N channels? A geometric distribution

34. מספר התעלות ב- patch At least no openings

35. מספר התעלות ב- patch Example mo- 1ms ms – 99ms Pon – 0.01 N=2 π=0.9949 no=300 (~30s recording) no double openings The data is insufficient to provide evidence that there is only one channel

36. מספר התעלות ב- patch Example mo- 1ms ms – 99ms Pon – 0.01 N=2 Π=0.9949 No=1200 (~2min recording) no double openings It is unlikely that more than one channel is functioning

37. קצת יותר פרקטיקה Colquhoun,D., and Hawkes,A.G. (1995). The principles of the stochastic interpretation of ion-channel mechanisms. In Single-channel recording, B. Sakmann, and E. Neher, eds. (New York: Plenum Press), pp. 397-482.

38. קצת יותר פרקטיקהפילטר • פתיחות מלבניות – Bessel filter (Gaussian filter) 5 kHz 8-pole Bessel 2 kHz Gaussian 2 kHz 8-pole Bessel 2 kHz 8-pole Butterworth

39. קצת יותר פרקטיקה Filter rise time Tr – risetime – the time of the output of a filter to make a transition when a square step is applied to the input It therefore corresponds to the minimum length of a pulse to which the filter gives a nearly full amplitude response

40. קצת יותר פרקטיקה fc – cutoff frequency 1-kHz Bessel filter Tr = 330μsec רצוי פילטר כמה שיותר מהיר כתלות ברעש 10kHz נחשב כ- analog

41. A2D • תדר דגימה איטי – איבוד מידע של שינויים מהירים (aliasing). • Nyquist rate – (כפול מהפילטר) – לא מתאים. • ללא שיטות אינטרפולציה רצוי פי 10-20 מתדר הפילטרציה Colquhoun,D., and Sigworth,A.G. (1995). Fitting and Statistical Analysis of Single-Channel Records. In Single-channel recording, B. Sakmann, and E. Neher, eds. (New York: Plenum Press), pp. 397-482. Nyquist rate

42. אנאליזהמציאת פתיחות • Half amplitude threshold analysis רק מ- Tr משך הפתיחות נכון Colquhoun,D., and Sigworth,A.G. (1995). Fitting and Statistical Analysis of Single-Channel Records. In Single-channel recording, B. Sakmann, and E. Neher, eds. (New York: Plenum Press), pp. 397-482. מתחת 0.6Tr לא מזהים פתיחה

43. אנאליזהמציאת פתיחות • Half amplitude threshold analysis Colquhoun,D., and Sigworth,A.G. (1995). Fitting and Statistical Analysis of Single-Channel Records. In Single-channel recording, B. Sakmann, and E. Neher, eds. (New York: Plenum Press), pp. 397-482.

44. Slow NMDAR Fast NMDAR Fast NMDAR AChR אנאליזהמציאת פתיחות מתי לחשוש מ- missed events?

45. אנאליזהמציאת אמפליטודה • ממוצע של אמפליטודת הפתיחות • All point amplitude histogram • רק פתיחות שמשכן מעל 2Tr

46. פתיחות עד טווח ביניים נקבע 3 exp רק פתיחות קצרות נקבע 2 exp כל ה- data נקבע 2 exp • Time histograms כל ה- data מזהים 3 exp Colquhoun,D., and Sigworth,A.G. (1995). Fitting and Statistical Analysis of Single-Channel Records. In Single-channel recording, B. Sakmann, and E. Neher, eds. (New York: Plenum Press), pp. 397-482.

47. מה חסר • מציאת פתיחות ו- Missed events • Amplitude histograms • עוד הרבה

48. טיפים • Seal guard • תמיסת אמבט • תמיסת פיפטה • תדר פילטרציה ברישום • תדר דגימה

49. TRPL דוגמא • שינוי ב: • מוליכות • הסתברות הפתיחה • משך הפתיחה • open channel block

50. דוגמא תעלת ה- TRPL של הדרוזופילה מה היונים הדיבלנטיים עושים?