第一单元
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第一单元 综合性实验 - PowerPoint PPT Presentation


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第一单元 综合性实验. 实验一 多克隆抗体制备. 多克隆抗体概念. 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的,由多种抗原决定簇刺激机体,相应地就活化多个 B 淋巴细胞克隆,所产生多个单克隆抗体( McAb )的混合物,此即为多克隆抗体。. 实验原理. 当抗原刺激机体免疫系统, B 细胞在 T 细胞的辅助下(多数抗原需要 T 细胞参与),识别抗原的 B 细胞表位( T 细胞识别 T 细胞表位)后, T 细胞和 B 细胞均活化,由 B 细胞针对抗原的 B 细胞表位产生的能与抗原 B 细胞表位结合并发挥生物学功能的免疫球蛋白。.

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Presentation Transcript

第一单元

综合性实验



多克隆抗体概念

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的,由多种抗原决定簇刺激机体,相应地就活化多个B淋巴细胞克隆,所产生多个单克隆抗体(McAb)的混合物,此即为多克隆抗体。

实验原理

当抗原刺激机体免疫系统,B细胞在T细胞的辅助下(多数抗原需要T细胞参与),识别抗原的B细胞表位(T细胞识别T细胞表位)后,T细胞和B细胞均活化,由B细胞针对抗原的B细胞表位产生的能与抗原B细胞表位结合并发挥生物学功能的免疫球蛋白。


实验器材和材料

  • 菌种:伤寒沙门菌O901和伤寒沙门菌H901菌株。

  • 动物:体重在2.5kg左右的健康青年新西兰家兔。

  • 培养基:细菌普通肉汤培养基、细菌普通固体培养基。

  • 试剂:

    人IgG、羊毛脂、石蜡油、注射用卡介苗、二甲苯、无菌生理盐水、0.5%无菌甲醛盐水、0.5%无菌石灰酸盐水、2 % NaN3和3 %戊巴比妥钠等。


  • 器械:细菌接种环、16号钢质注射针头(或7号留置针)、注射器三通阀、5ml无菌玻璃注射器、兔子固定架,灭菌三角烧瓶(200 ml)和烧杯(200 ml)、平皿(直径9 cm)等。

  • 其他:酒精棉、脱脂棉、塑料放血管、纱布、800ml细菌培养用克氏培养瓶,标准麦氏比浊管和50ml圆底进口离心管或100~500ml细菌离心瓶。

  • 仪器:37℃恒温培养箱、37℃恒温气浴(或水浴)摇床、低温高速大容量离心机(水平转子,至少能满足50ml离心管的离心)。


伤寒沙门菌O901、H901

O901、H901菌液

耳缘静脉注射(1×109/ml )

18~24h后,用无菌生

理盐水菌苔洗下接种

18~24h后,分别用无菌0.5%石灰

酸盐水和甲醛生理盐水洗下菌苔

无菌试验(37℃恒温摇床)

耳正中动脉采血

大容量低温高速离

心机离心收集细菌

试管凝集试验鉴定

实验方法

抗颗粒性抗原抗体制备程序


1

2

6

5

3

4

抗可溶性抗原抗体制备程序

背部多点注射

弗氏不完全佐剂

羊毛脂1份 + 石腊油5份

混合高压灭菌

耳缘静脉

最后耳缘静脉

注射加强免疫

耳正中动脉

用人IgG与不完全佐剂按1:1体积比加入,卡介苗的终浓度为1~20 mg/ml。

弗氏完全佐剂

耳缘静脉采血

抗体效价滴定

推成油包水制剂


注意事项

选择合适的动物种属及品系;良好的抗原质量和合适的剂量;合理的修饰;适当的佐剂、免疫强度和免疫途径,有助于提高免疫效果;动物的健康状况等。


实验结果分析和讨论

实验结果: 观察免疫效果如何?

分析和讨论:

实验结果或失败的原因,哪些方面还存在问题?

抗原制备是否达到要求?

佐剂制备的情况?

动物状态?

采血方式?

江苏大学 邵启祥



单克隆隆抗体概念

一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞克隆接受该抗原决定簇所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monclone antibody,McAb)。

实验原理

采用杂交瘤技术将抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合剂融合,杂交瘤既保持B淋巴细胞分泌抗体的能力,又获得了骨髓瘤细胞无限增殖的能力,最后通过筛选获得针对某一抗原决定簇的抗体,此即为McAb。


实验器材和材料

细胞:SP2/0细胞系、人“O”型红细胞悬液(红细胞反复

洗涤直至不溶血为止,浓度调整至2×107/ml)。

试剂: 50 %(W/V)的聚乙二醇(PEG 1500)、

100×HT母液、100×A母液、琼脂糖、降植烷、二甲基

亚砜、Tris碱、盐酸、硫酸铵液、DEAE-纤维素、

RPMI-1640培养液和新生牛血清。

动物:采用和杂交瘤同源的8周龄的Balb/c健康小鼠,鼠

龄在;另备经产母鼠3~5只。


  • 耗材:24孔和96孔细胞培养板、无菌毛细滴管、1ml无菌刻度吸管。

  • 器械:无菌直头和弯头眼科剪各3把、无菌直头和弯头眼科镊3把。

  • 仪器:水平低温冷冻离心机、CO2培养箱。


眼眶采血

洗至不溶血

IF鉴定

2×107/ml

腹腔注射

“O”型血

离心

实验方法

红细胞免疫


杂交瘤融合

1×105/ml饲养细胞

6 %淀粉肉汤

IF鉴定

IF鉴定

再次克隆化

有限稀释克隆化

HAT筛选

脾细胞10份

50%PEG

+

免疫小鼠

秋水仙素鉴定小鼠染色体

融合

无血清培养基

sp2/0细胞1份

胶体金

IgG亚型鉴定

特异性和

效价鉴定


注意事项

  • 选择的动物状态要好;免疫后效价要高;融合效率要比较高,筛选到阳性克隆的几率也要比较高;饲养细胞很重要。

实验讨论

  • 单克隆抗体的优点和可能的应用范围。

江苏大学 邵启祥



实验原理

  • NaIO4是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体,反应式如下:


实验器材和材料

  • 试剂:抗人IgG抗体、HRP、0.30 M pH 8.1 NaHCO3(现用现配)、1 %氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液、0.08 M NaIO4、0.16 M乙二醇溶液、0.10 M pH 9.5 NaHCO3缓冲液、0.01M碳酸盐缓冲液、氢化硼钠(NaBH4)、0.15M pH7.4 PBS缓冲液、pH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液和萘氏试剂。

  • 仪器:搅拌器、分光光度计、普通低速冷冻离心机和高速冷冻离心机。

  • 材料:透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。


实验方法

  • 标记:

    将5mg HRP溶于1ml 0.30 M pH 8.1 NaHCO3中,加0.1ml 1%氟二硝基苯无水乙醇溶液,混合,加入1ml 0.04M~0.08M NaIO4,室温轻搅30min。至黄绿色时,加1ml 0.16M乙二醇溶液终止反应,室温1h。置于4℃0.10M pH 9.5 NaHCO3透析。然后于3ml HRP-醛基溶液中,加入5mg抗体,室温置3h,加入5mg氢化硼钠,4℃过夜,0.15M pH7.4 PBS液透析过夜,离心去沉淀物。


  • 纯化:

    将上述上清夜在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵, 4℃1h。3000rpm离心30min,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中,于0.15M pH7.4的PBS缓冲盐水透析,直至完全去除铵离子(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30min去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。也可以用0.22μm滤膜或≥12,000rpm高速冷冻离心5min除菌后分装于EP管中,加入30%~50%无菌甘油,-20~-80℃保存。


  • 鉴定

  • 琼脂双向扩散试验鉴定酶标抗体的活性

    制备琼脂糖双向扩散板,打孔,在抗原孔和抗体孔中分别加入酶标抗IgG抗体和IgG(浓度为1 mg/ml),扩散24 h,观察沉淀线。洗涤后置于底物DAB溶液中避光显色20 min,生理盐水漂洗。如有沉淀线、且能在底物中显色,并漂洗后不褪色,说明酶和抗体都具有活性。酶标结合物琼脂扩散滴度应在1:16以上。


  • 酶结合物的定量测定

    测定酶结合抗体的OD280 nm和OD403 nm值

    IgG含量(mg/ml)=(OD280 nm-OD403 nm×0.42)

    ×0.94×0.62

    克分子比值=(酶/40000)/IgG/160000

    酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量

    ×100%。

    酶标记率:OD403 nm/OD280 nm

  • ELISA试验 (第四单元 实验一)


注意事项

  • 高质量的酶和高纯度的抗体是高效价酶标抗体的保证。

  • 标记后的抗体活性要好。

  • 所使用试剂的pH和浓度及用量必须严格掌握。戊二醛必须新鲜纯品,临时用临时配制。

  • 室温搅拌时须避光,室内温度一般在25 ℃为宜。

  • 标记物每次透析前,须认真检查,防止漏液。

  • 浓的标记物相当稳定,常加入30~40 %甘油于-10 ℃下保存。4 ℃可保存1~2年,但稀释成1∶10,只能保存数周。已配制的工作液应在12 h 内用完。切忌反复冻融。


实验讨论

从酶标记技术原理,谈谈该技术在基础和临床诊断中的应用。

江苏大学 邵启祥


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