ΜΑθημα ETY-494 «Ειςαγωγη ςτην ΒιοϊατρικΗ ΜηχανικΗ»

1. ΜΑθημα ETY-494«Ειςαγωγη ςτην ΒιοϊατρικΗ ΜηχανικΗ» Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Υλικών, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Κρήτης Δρ. Γεώργιος Βλαστός (E-mail: vlastos@materials.uoc.gr) Ιστοσελίδα Μαθήματος: http://www.materials.uoc.gr/courses/ETY494 Βιοϊατρική Μηχανική Βλαστοκυττάρων. Μέρος Α: Βασικές Έννοιες

2. Απώλεια κυττάρων και ιστού οργάνων • Γήρανση • Χημοθεραπεία • Σωματικό η ισχαιμικό τραύμα • Έμφραγμα του μυοκαρδίου • Εγκεφαλικό • Κάταγμα σπονδυλικής στήλης • Εκφυλιστικές ασθένειες • Alzheimer • Parkinson • Διαβήτης • Αρθρίτιδα • Οστεοπόρωση • Νεφρική ανεπάρκεια

3. Βιοϊατρική Μηχανική ΒλαστοκυττάρωνStem Cell Bioengineering • Στο άμεσο μέλλον οι θεραπείες με βλαστοκύτταρα θα αποτελούν όλο και περισσότερο κλινική πρακτική και ερευνητικό αντικείμενο. • Η Αναπαραγωγική Ιατρική (Regenerative Medicine) και η Ιστομηχανική (Tissue Engineering) συνδυάζουν τους κλάδους της Βιολογίας και της Βιοϊατρικής Μηχανικής για την ανάπτυξη βιολογικών υποκατάστατων, που σκοπός τους είναι η επαναφορά και η αναπαραγωγή ιστών και οργάνων του σώματος ύστερα από βλάβες. • Επειδή στην ΑναπαραγωγικήΙατρική τα πρόδρομα και βλαστικά κύτταρα (progenitor and stem cells) καλλιεργούνται σετρισδιάστατα ικριώματα (scaffolds) όπου τα κύτταρα προσκολλούνται και διαφοροποιούνται,τα βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται παίζουν κρίσιμο ρόλο. • Ανάπτυξη δυνατότητας εφαρμογών Γενετικής Μηχανικής για γονιδιακή θεραπεία. • Αντιμετώπιση του προβλήματος έλλειψης δοτών οργάνων και παράνομου εμπορίου οργάνων κυρίως στον τρίτο κόσμο. Nature Biotechnology, Vol. 18, 201-206, 2001

4. Τι είναι τα βλαστοκύτταρα; • Το βλαστοκύτταρο ορίζεται με 3 κριτήρια: • Αυτο-ανανέωση. • Δυνατότητα διαφοροποίησης σε πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους. • Ικανότητα να επαναφέρει στην αρχική του μορφή ένα δεδομένο ιστό. • Το πλέον πρωτόγονο βλαστοκύτταρο στον οργανισμό είναι το γονιμοποιημένο ωάριο (fertilized oocyte or zygote). • Όταν το ωάριο διαιρείται, οι απόγονοί του ύστερα από δύο κυτταρικές διαιρέσεις αντιπροσωπεύουν τα ολοδυναμικά κύτταρα (totipotentcells) που δημιουργούν μια κοίλη κυτταρική μπάλλα την βλαστοκύστη (blastocyst) η οποία περιέχει μία συστάδα από κύτταρα που ονομάζεται εσωτερική κυτταρική μάζα (inner cell mass). Από αυτήν αναπτύσσεται το έμβρυο και παράγονται τα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (πάνω). • Oι περισσότεροι ιστοί έχουν πολυδυναμικά κύτταρα (multipotent stem cells) που μπορούν να παράξουν περιορισμένες κυτταρικές σειρές (μέση). • Τα μονοδυναμικά βλαστοκύτταρα (unipotent stem cells) παράγουν ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρων (κάτω). Goessler et al.Cells Tissues Organs 183:169–179, 2006

5. Προέλευση των βλαστοκυττάρων • Εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα (embryonic stem cells) • Παίρνονται από την βλαστοκύστη του εμβρύου. • Σε αργότερο στάδιο μπορούν να παρθούν πιο εξειδικευμένες κυτταρικές σειρές όπως π.χ. τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (embryonic Endothelial Progenitor Cells, eEPC). • Στο νωτιαίο μυελό βρίσκουμε διάφορα είδη εφήβων βλαστοκυττάρων (adult stem cells) • Τα κυκλοφορούντα ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (circulating endothelial progenitor cells). • Τα αιματοποιητικά βλαστοκύτταρα (hematopoetic stem cells, HSC). • Τα μεσενχυμικά βλαστοκύτταρα (mesenchymal stem cells, MSC). • Τα πολυδυναμικά έφηβα πρόδρομα κύτταρα (multipotential adult progenitor cells, MAPC) είναι υποκατηγορία των μεσενχυμικών βλαστοκυττάρων. Goessler et al.Cells Tissues Organs 183:169–179, 2006

6. Ανθρώπινη εξέλιξη και βλαστοκύτταρα (video) Human embryonic development depends on stem cells. During the course of development, cells divide, migrate, and specialize. Early in development, a group of cells called the inner cell mass (ICM) forms. These cells are able to produce all the tissues of the body. Later in development, during gastrulation, the three germ layers form, and most cells become more restricted in the types of cells that they can produce.

7. Ectoplacental Blood Islands Cone Chorion Endoderm Endothelial cells Exocoelomic Mesoderm Cavity Allantois Endocardium Amniotic Cavity Ectoderm Endoderm Mesoderm Vasculogenesis Mouse day 7.5 Undiffer- entiated The vascular system arises early in embryogenesis to meet thenutritional needs of the developing organism. At E7.5 in the mouse, the extraembryonic mesodermal cells ofthe yolk sac aggregate into clusters that constitute the initialstage of blood island formation. Shortly thereafter, bloodislands differentiate into an external layer of endothelial cellsand an inner core of blood cells . At about thesame time, embryonic cells of the proximal lateral mesodermassemble into pre-endocardial tubes that connect anteriorly to generate cardiac endocardium around the anterior intestinalportal. Blood cells Vasculogenesissignifies de novo formation of blood vessels from angiogenic precursor cells. Later in embryogenesis, the vascular tree grows by sprouting, cell division, migration and assembly of endothelial cells derived from pre-existing vessels through a process termed angiogenesis 1st Aortic Arch Amnion Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

8. Isolation of embryonic Endothelial Progenitor Cells (eEPCs) Properties of embryonic EPCs 1. Unlimited stem-cell like growth 2. Amenable to geneticengineering 3. Early isolation: a panel of “WT” and “KO” eEPCs 4. Plasticity - in vivo potential Embryo day 7.5 Primary eEPC lines Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

9. Παραγωγή εμβρυϊκών κυτταρικών σειρών στο εργαστήριο (video) The inner cell mass (ICM) cells of blastocyst-stage early human embryos can be removed and cultured. These cells can be grown in the lab indefinitely. Various growth factors cause these cells to develop into a variety of differentiated cells, such as muscle or nerve cells.

10. Gene induction: effector genes Angiogenesis VEGFR-1 VEGFR-2 Tie-1 Tie-2 Eph-B4 ephrin-B2 VEGF-A Ang2 TGFb TGFb RII Alk-1 SCL CBF Coagulation Thrombomodulin vWF Tissue Factor thrombin receptor eNOS PECAM-1 Inflammation E-selectin P-selectin VE-cadherin VCAM-1 Toll-like R2 Toll-like R4 CXCR 2, and 8 CCR 1, 3, 5 and 8 NF-kB Atherosclerosis ApoE glutathione peroxidases oxidative stress-induced protein transthyretin M-CSF Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

11. EMBRYONIC EPCs FORM VASCULAR STRUCTURES IN VIVO A: Host B: Donor (eEPCs) C: Incorporation Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

12. Induced genes eEPCs express key genes for vascular formation and endothelial cell function - Undifferentiated + Differentiated eEPCs Hatzopoulos et al. Development 125:1457-1468, 1998

13. Βλαστική ετερογένεια στους ιστούς και λειτουργικότητα των βλαστοκυττάρων γιά ανανέωση Rando AT, Nature 2006

14. Διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων (video) As a human embryo develops, its cells become progressively restricted in the types of specialized cells that they can produce. Inner cell mass (ICM) cells of the blastocyst can make any type of body cell. Gastrula-stage cells can give rise to the cells of a given germ layer. Later, cells become even more restricted. For example, the pancreatic bud of the endoderm layer can only make the cells of the pancreas.

15. Επίδραση των αυξητικών παραγόντων σε οστεομυϊκούς ιστούς Για την καλλιέργεια και διαφοροποίηση βλαστοκυττάρων και μοσχευμάτων βλαστοκυττάρων χρησιμοποιούνται εξωτερικοί αυξητικοί παράγοντες όπως οι κυτοκίνες. Αυτές σπρώχνουν τα βλαστοκύτταρα να διαφοροποιηθούν σε συγκεκριμένη κατεύθυνση, χρησιμοποιώντας την ανασυνδυαζόμενη τεχνολογία DNA. Οι αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών με τα κύτταρα και τα μηχανικά ικριώματα όπου εδράζονται τα κύτταρα, έχουν μεγάλη σημασία γιά την αναπαραγωγή του ιστού. Goessler et al.Cells Tissues Organs 183:169–179, 2006

16. Μεταγραφικοί παράγοντες που χαρακτηρίζουν τη διαφοροποιήση των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε κύτταρα της καρδιάς Srivastava & Ivey, Nature 2006

17. 20% FBS EBM+ Single Quots 20% FBS DMEM + 100 μg/mL ECGS Adherent cells after 2 weeks on 24-well fibronectin coated culture plates (8.75x105 MNCs/well) AcLDL and Lectin staining of EPCs isolated from human peripheral blood after 6 days in culture on glass slides in DMEMsupplemented with 20%FBS and 100 mg/mL ECGS(Initial density of MNCs: 8.75x105 cells/well) AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus Double Staining Rat VSMCs Negative Control AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus Double Staining EPCs Fibronectin AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus Double Staining EPCs Gelatin AcLDL Ulex Europaeus AcLDL / Ulex Europaeus Double Staining Human microvascular ECs Positive Control

18. Τα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναιανοσοπρονομιούχα (immunoprivileged) • Τα εμβρυϊκά πρόδρομα βλαστοκύτταρα είναιανοσοπρονομιούχα (immunoprivileged) και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε θεραπείες και να μην απορρίπτονται σαν μόσχευμα, κάτι που συμβαίνει με άλλους τύπους κυττάρων, μετά από μέτρηση με Κυτταρομετρία Ροής (Flow Cytometry, Fluorescent Activated Cell Sorting; FACS). • Σε υποξικές συνθήκες έχουμε ανεβασμένη έκφραση του VEGF σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Το VEGF αυξάνει την αγγειογένεση και ασκεί πολλαπλασιαστική και αντι-αποπτωτική επίδραση στύς όγκους και στα ενδοθηλιακά κύτταρα των όγκων. Wei et al. Cancer Cell, 2004

19. Προοπτικές χρήσης των βλαστοκυττάρων • Η έρευνα στα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα συναντά βιοηθικά εμπόδια, γι’ αυτό και έχει αναπτυχθεί πολύ η έρευνα στα βλαστοκύτταρα ποντικού που είναι γενετικά κοντά στον άνθρωπο. • Επίσης χρησιμοποιούνται συχνά ανθρώπινα έφηβα βλαστοκύτταρα τα οποία αν και λίγα σε αριθμό, είναι αυτόλογα, μπορούν να παρθούν από το αίμα και το νωτιαίο μυελό και βοηθούν να ξεπεραστούν τα βιοηθικά διλλήματα που υπάρχουν με την χρήση εμβρύων. • Πρόσφατες ανακαλύψεις που μετατρέπουν π.χ. τα δερματικά κύτταρα σε άλλους τύπους κυττάρων, προβλέπεται να χρησιμοποιούνται ευρύτατα στο μέλλον για την Αναπαραγωγική Ιατρική.

20. Embryonic endothelial progenitor cell (eEPC) homing in ischemic/hypoxic areas • Tα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά βλαστοκύτταρα έχουν την ιδιότητα να καταφεύγουν σε ισχαιμικές/υποξικές περιοχές της κυκλοφορίας. • Προωθούν την δημιουργία νέων αγγείων και βελτιώνουν την αποκατάσταση των ιστών μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου. • Μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν κυτταρικό όχημα γιά γονιδιακή θεραπεία. • Δεν γνωρίζουμε το μηχανισμό του homing. • Είναι πιθανό τα βλαστοκύτταρα να εκφράζουν παράγοντες που λόγω αυτών να έλκονται στις ισχαιμικές περιοχές. Kupatt et al. FASEB, 2005

21. Τεχνική μικροσυστοιχίας DNA (video) Dr. Melton describes the process used to extract DNA from a cell and to analyze it on a gene chip. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

22. Εκκρινόμενοι παράγοντες από τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (eEPC)

23. ...συνέχεια

24. ...συνέχεια

25. Ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα σε καλλιέργεια (video) Cell cultures derived from human embryonic stem cells can reproduce indefinitely and also differentiate into specialized cell types, including beating heart cells. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

26. Μεταφορά πυρήνα σωματικού κυττάρου (video) Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is performed looking through a microscope and using small glass pipettes to handle human eggs and to remove and transfer nuclei from one cell to another. SCNT is used to produce clones of cells with the same genetic background as the donor nucleus. Also featured on the DVD Potent Biology: Stem Cells, Cloning, and Regeneration, available free from HHMI.

27. Επόμενοσεμινάριο: Μηχανική Βλαστοκυττάρων.Μέρος Β: Κλινικές εφαρμογές • Στο επόμενο μάθημα θα ασχοληθούμε με κλινικές εφαρμογές της Μηχανικής Βλαστοκυττάρων. • Θα επικεντρωθούμε στις εφαρμογές στο καρδιοαγγειακό σύστημα. • Τρόποι έκχυσης βλαστοκυττάρων στο σώμα. • Γονιδιακή Μηχανική. • Επισκόπηση των σημαντικότερων μελετών σε ζώα και ανθρώπους. • Προβλήματα τεχνικής και ηθικής φύσεως...