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第六章 核酸化学 Nucleic acid

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第六章 核酸化学 Nucleic acid. 第一节 概述. 核酸 (nucleic acid) 以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,携带和传递遗传信息。 DNA ( D eoxyribo n ucleic a cid) 脱氧核糖核酸 RNA ( R ibo n ucleic a cid) 核糖核酸. 一、核酸的发现和研究工作进展. 1868 年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取“核素” 1944 年 Avery 等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson 和 Crick 发现 DNA 的双螺旋结构

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Presentation Transcript
slide2

第一节 概述

核酸(nucleic acid)

以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,携带和传递遗传信息。

DNA(Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸

RNA(Ribonucleic acid) 核糖核酸

slide3

一、核酸的发现和研究工作进展

  • 1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”
  • 1944年Avery等人证实DNA是遗传物质
  • 1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构
  • 1966年 Nirenberg发现遗传密码
  • 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶
  • 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法
  • 1985年 Mullis发明PCR 技术
  • 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)
  • 1999年 中国加入人类基因组计划
  • 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架
  • Post-genome era/OMICS era
slide4

二、核酸的分类及分布、功能

90%以上分布于细胞核,其余分布于核外如线粒体,叶绿体,质粒等。

脱氧核糖核酸

(deoxyribonucleic acid, DNA)

携带遗传信息,决定细胞和个体的基因型(genotype)。

核糖核酸

分布于胞核、胞液。

(ribonucleic acid, RNA)

参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。

slide6

一、元素组成

  • 主要元素组成: C、H、O、N、P(9~11%)
  • 与蛋白质比较,核酸一般不含S,而P的含量较为稳定,占9-11%。

二、基本构成单位:核苷酸(nucleotide)

核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成

slide11

碱基的结构特征

嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系,在紫外区有吸收(260 nm左右)。

slide13

2. 核苷 (nucleoside)

糖与碱基之间的C-N键,称为C-N糖苷键。

核糖核苷:AR, GR, UR, CR

脱氧核苷:dAR, dGR, dTR, dCR

slide14

3. 核苷酸(ribonucleotide)

核苷和磷酸以磷酸酯键连接

slide15

稀有核苷酸

核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多,大部分是上述碱基的甲基化产物。

slide18

1、核苷酸的组成:含氮碱基、戊糖和磷酸。

2、稀有核苷酸:稀有碱基/核苷/核苷酸

3、核苷酸的其他形式

  • 多磷酸核苷(NDP、NTP)
  • 环化核苷酸(cAMP、cGMP等)
  • 辅酶或辅基(NAD、NADP、FAD、CoA等,均含有AMP)
  • 活性代谢物(UDPG、CDP-胆碱等)
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ATP

  • ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。
  • ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。
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cAMP和cGMP

  • cAMP(3’,5’-环化腺苷酸)和cGMP(3’,5’-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。
  • cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4, cAMP和cGMP的水解能约为43.9 KJ/mol,比ATP水解能高得多。
slide23

一、一级结构(primary structure)

一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。

1、核苷酸的连接方式: 3, 5磷酸二酯键

2、核酸的基本结构形式:多核苷酸链

  • 信息量:4n
  • 末端: 5’端、 3’端
  • 多核苷酸链的方向: 5’→3’

3、表示方法:结构式、线条式、文字缩写

slide25

DNA双螺旋结构的研究背景

  • 碱基组成分析——Chargaff 规则:[A] =[T];[G] [C]
  • 碱基的理化数据分析:A-T、G-C以氢键配对较合理
  • DNA的X-线衍射图谱分析
slide26

二、DNA的空间结构

1. DNA的二级结构(secondary structure)

(1) 碱基组成规则(Chargaff规则)

  • [A]=[T],[G]=[C];

[A]+[G]=[T]+[C](嘌呤与嘧啶的总数相等)

  • 有种属特异性
  • 无组织、器官特异性
  • 不受年龄、营养、性别及其他环境等影响
slide27

(2) DNA双螺旋(double helix model)结构要点

  • DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕,形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反,即其中一条链的方向为5′端→3′端,而另一条链的方向为3′端→5′端。
slide28
嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成90°角。嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成90°角。
slide29
螺旋横截面的直径约为2nm,每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm,每10个核苷酸形成一个螺旋,其螺矩(即螺旋旋转一圈的高度)为3.4 nm。

34Å

slide30
维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合,G与C结合,这种配对关系,称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键,G与C之间形成三个氢键。维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合,G与C结合,这种配对关系,称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键,G与C之间形成三个氢键。

在DNA分子中,嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。

slide32

螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove),彼此相间排列。小沟较浅;大沟较深,是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。

  • 氢键维持双链横向稳定性,碱基堆积力维持双链纵向稳定性。
slide33

其他螺旋形式

  • Z-DNA(左手双螺旋)
  • A-DNA
3 dna
(3)DNA双螺旋的稳定性

DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。

维持这种稳定性的因素包括:两条DNA链之间形成的氢键,碱基堆积力。

双螺旋结构内部形成的疏水区,消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响;

介质中的阳离子(如Na+、K+和Mg2+)中和了磷酸基团的负电荷,降低了DNA链之间的排斥力等。

改变介质条件和环境温度,将影响双螺旋的稳定性。

slide36

天然存在的DNA分子最显著的特点是很长,分子质量很大,一般在106~1010。天然存在的DNA分子最显著的特点是很长,分子质量很大,一般在106~1010。

  • 大肠杆菌染色体由400万碱基对(basepair,bp)组成的双螺旋DNA单分子。其长度为1.4×106nm,相当于1.4mm,而直径为20nm,相当原子的大小。
  • 黑腹果蝇最大染色体由6.2×107bp组成,长2.1cm
  • 多瘤病毒的DNA由5100bp组成 ,长1.7mm
2 dna
2.DNA的三级结构

双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括:线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等

slide38

10nt/圈为能量最低状态,<10时形成右手(负)超螺旋;>10时形成左手(正)超螺旋。10nt/圈为能量最低状态,<10时形成右手(负)超螺旋;>10时形成左手(正)超螺旋。

连环数 (L):一条链绕另一条链缠绕次数

扭转数 (T):DNA双螺旋圈数

超螺旋数 (W):超螺旋数

L=T+W

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3. DNA在真核生物细胞核内的组装

核小体(nucleosome): 由DNA和组蛋白构成。

  • 组蛋白核心---八聚体H2B ,H2A ,H3 ,H4
  • DNA:以左手螺旋缠绕在组蛋白上---1.8圈(146 bp)
  • H1组蛋白在核小体之间的连接DNA上(54bp)
4 dna
4. DNA的功能

DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息,并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础,也是个体生命活动的信息基础。

基因从结构上定义,是指DNA分子中的特定区段,其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。

1 rna
1. RNA的结构特点

RNA是单链分子,因此在RNA分子中,嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。

RNA分子中,部分区域也能形成双螺旋结构,不能形成双螺旋的部分,则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。

在RNA的双螺旋结构中,碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外,也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。

tRNA中除了常见的碱基外,还存在一些稀有碱基,这类碱基大部分位于突环部分.

slide44

2. 信使RNA的结构与功能

(1) 真核生物mRNA的结构特点

  • 大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷,同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化,形成帽子结构:m7GpppNm-。
  • 2. 大多数真核mRNA的3´末端在转录后加上一多聚腺苷酸(polyA)结构(20-250nt)。
slide45

帽子结构和多聚A尾的功能

  • mRNA核内向胞质的转运
  • mRNA的稳定性维系
  • 翻译起始的调控
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(2)真核生物mRNA成熟过程

hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)

Eukaryote

Polycistronic mRNA

Prokaryote

slide47

细胞质

真核细胞

细胞核

内含子

外显子

DNA

原核细胞

DNA

转录

转录

mRNA

hnRNA

转录后剪接

转运

翻译

蛋白

mRNA

翻译

蛋白

(3)mRNA的功能

把DNA所携带的遗传信息,按碱基互补配对原则,转录并传送至核糖体,用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。

3 trna
3. tRNA的结构与功能

(1) tRNA的一级结构特点

含 10~20% 稀有碱基,如 DHU

3´末端为 - CCA-OH

5´末端大多数为G

具有 TC

次黄嘌呤(I)

假尿嘧啶()

双氢尿嘧啶(DHU)

slide49

3`末端的CCA-OH单链用于连接该tRNA转运的氨基酸

(2) tRNA的二级结构

-----三叶草形

  • 氨基酸臂
  • DHU环
  • 反密码子环:
  • 额外环
  • TΨC环

IV

I

III

核糖体识别结合位点

识别氨酰-tRNA合成酶

II

与mRNA的三联体密码互补配对,称为反密码子(anticodon)

slide51

(3) tRNA的功能:

活化、搬运氨基酸到核糖体,参与蛋白质的合成。

slide52

4. rRNA的结构与功能

(1)rRNA的功能:

组成核蛋白体,作为蛋白质合成的场所。

核糖体的组成

slide54

5. 其他小分子RNA

除了上述三种RNA外,细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA,统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。

  • 种类:核内小RNA;核仁小RNA;胞质小RNA;催化性小RNA;小片段干涉 RNA
  • 功能:参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此,有人也将其称为调节RNA(regulatory RNA)。
slide55

小片段干扰RNA (siRNA):一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference,RNAi,也译作RNA干预或干涉)。

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RNAi的作用机制:

1)在起始步骤,生物宿主将外源基因表达的双链RNA进行切割,产生具有特定长度(19-21nt)和序列的小片段siRNA;

2)siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物(RISC)。RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3\'端12个碱基的位置切割mRNA。

slide58

一、核酸的一般理化性质

1、DNA白色纤维状固体,RNA白色粉末状固体,都微溶于水,不溶于乙醇,因此常用乙醇来沉淀DNA ; DNA溶液黏度大于RNA ;

2、 DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液,可溶于1~2 mol/L的NaCl溶液,RNA则相反,可据此分离二者;

3、特征颜色反应

D-核糖+浓盐酸+苔黑酚 绿色;

D-2-脱氧核糖+酸+二苯胺 蓝紫色

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二、核酸的水解

1、酸水解

糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解;嘌呤糖苷键酸中最易被打开

2、碱水解

糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解;由于RNA中2‘-OH参与形成环磷酸酯,RNA更易发生碱水解

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3、酶水解

  • 核酸酶的分类

底物:核糖核酸酶(RNase),脱氧核糖核酸酶(DNase)

作用方式:内切酶和外切酶

磷酸二酯键断裂方式:

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Py Pu Py Py Pu Py

  • 核糖核酸酶类

牛胰核糖核酸酶 (RNase I)

作用位点:嘧啶核苷-3’-磷酸与其他核苷酸间的连键

核糖核酸酶 T1(RNase T1)

A G U G C A

作用位点:3’鸟苷酸与其他核苷酸5‘-OH的连键

slide63

EcoR I

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

Enzyme number

E. coli

strain

  • 脱氧核糖核酸酶类

牛胰脱氧核糖核酸酶 (DNase I)

将dsDNA或ssDNA切成5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸

限制性内切酶 (restriction endonuclease)

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三、紫外吸收

  • 最大吸收波长:260nm
  • 核酸定量分析
  • 核酸定性分析
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OD260的应用

  • 1. DNA或RNA的定量
    • OD260=1.0相当于
      • 50μg/ml双链DNA
      • 40μg/ml单链DNA(或RNA)
      • 20μg/ml寡核苷酸
  • 2.判断核酸样品的纯度
    • DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8
    • RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0
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四、变性、复性、分子杂交

1、DNA变性(DNA denaturation)

DNA变性是指在理化因素作用下,DNA分子中的氢键断裂,碱基堆积力遭到破坏,双螺旋结构解体,双链分开形成单链的过程。

方法:过量酸,碱,加热,变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。

slide67

DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,一级结构不变DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,一级结构不变

  • 变性后其它理化性质变化:OD260增高;粘度下降;比旋度下降;浮力密度升高;酸碱滴定曲线改变;生物活性改变
slide68

(1)增色效应:DNA变性时其溶液OD260增高的现象。(1)增色效应:DNA变性时其溶液OD260增高的现象。

slide69

(2)DNA的热变性

当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时,双螺旋结构即发生解体,两条链彼此分开,形成无规线团。

  • 融解温度(melting temperature, Tm):DNA热变性过程中,紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度(Tm)或解链温度、变性温度。
slide71

DNA的性质和组成: GC含量越高,Tm越大

在pH7.0, 0.165 mol/L NaCl溶液中

(G+C)% =(Tm-69.3)×2.44

slide72

2. DNA复性

  • DNA复性(renaturation)的定义: 在适当条件下,变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象,这一现象称为复性。
  • 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程称为退火(annealing)。
  • 减色效应(hypochromic effect ): DNA复性时,其溶液OD260降低。
slide73

核酸分子杂交(hybridization)

  • DNA复性过程中,如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中,只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对,在适宜的条件(温度及离子强度)下,可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种现象称为核酸分子杂交。
slide77

一、核酸的分离提纯和定量测定

1. DNA的分离

真核生物中的染色体DNA常与碱性蛋白结合成核蛋白(DNP)形式存在于核内。

浓盐法:

用浓盐(1MNaCl)提取出DNP;

用氯仿/异丙醇,除去蛋白质;

冷乙醇沉淀出DNA;

slide78

2. RNA的分离

  • 因为RNase无处不在而得RNA提取分离更为困难。
  • 所有玻璃器具都应高温灭菌,不能高温高压的用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理
  • 破碎细胞时使用强变性剂,如胍盐,使酶失活;
  • 在RNA反应体系内加入RNA酶的抑制剂;
  • 目前最常用的RNA制备方法有两个:
  • 1)用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提:少量制备RNA。
  • 2)用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心:大量制备RNA
slide79

3. 核酸的定量测定

紫外吸收法

1个A~50μg/ml 双链DNA

~40μg/ml RNA或单链DNA

定糖法

RNA:核糖→ 糠醛 绿色物质(670-680nm)

DNA:脱氧核糖+二苯胺 兰色物质(595-620nm)

苔黑酚

slide80

定磷法

核酸含磷量为9.5%

1g磷相当于10.5g核酸

琼脂糖凝胶电泳

溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物

在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光

荧光强度与DNA含量成正比

slide81

二、核酸的沉降特性与超速离心

不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),密度和沉降速率不同,用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。

石蜡油

蛋白质

开环/线性DNA

环形DNA

超螺旋DNA或RNA

slide82

核酸密度测定

8M CsCl,45000 rpm,16h

密度梯度:1.80g/ml→1.55g/ml

平衡时:浮力密度=CsCl密度=离心力

ρ=ρ0 +4.2ω2(r2 - r02) × 10-10

ρ0:标准DNA浮力密度

ρ :浮力密度(未知)

ω :角速度(弧度/秒)

r:样品到转轴的距离

G-C含量与DNA的浮力密度之间关系

ρ=0.1 xG-C + 1.658

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三、核酸的凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳:用于大片段DNA的分离,精度低,但分离范围广;

聚丙烯酰胺凝胶电泳:小片段核酸分离

slide84

四、核酸的核苷酸序列测定

1.DNA的酶法测定

Sanger测定DNA核苷酸序列的方法:DNA合成终止法(双脱氧DNA链合成终止法)。

slide86

DNA序列分析仪:

四色荧光基团标记的dNTP

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2. DNA的化学法测序:

由Maxam和Gilbert所发明。

其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基,然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应,可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断,其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱

slide88

4组特异的反应如下:

(1)G反应:用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化,加热引起鸟嘌呤脱落,多核苷酸链可在此处断裂

(2)G+A反应:用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化,从而使其糖苷键变得不稳定,再用哌啶使键断裂

(3)T+C反应:用肼使T和C的嘧啶环断裂,再用哌啶除去碱基

(4)C反应:当有盐存在时,只有C与肼反应,并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落,并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂

slide89

32P *ACTTCGACAG

肼/NaCl(C):

*AC

*ACTTC

*ACTTCGA C

*ACTTCGACAG

肼(C+T):

*AC

*ACT

*ACT T

*ACTTC

*ACTTCGAC

*ACTTCGACAG

硫酸二甲酯(G):

*ACTTCG

*ACTTCGACAG

甲酸(G+A):

*A

*ACTTCG

*ACTTCGA

*ACTTCGACA

*ACTTCGACAG

从下往上读:CTACGTA,末端G不能读出。

slide90

五、聚合酶链式反应 (PCR)

  • 1995年K.Mullis发明。基本步骤为:
  • 设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列,并尽量减少可能产生的非特异产物
  • 优化反应体系:包括适量模板、引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶和适量Mg2+
  • 选择3个温度进行热循环:变性94℃,45-60s;退火,根据引物的Tm ,1min;延伸,72℃,1min。循环
  • 扩增完成后取出一定量的反应产物,检测扩增结果:先进行凝胶电泳,用溴化乙啶染色,紫外光下检测结果
slide91

Thermal Cycler Steps

Denature

double-stranded DNA

Anneal

primers to single-stranded DNA

Extend primers,

yielding new double-stranded DNA

Cycling:Repeat

steps 1 through 3 (20 - 40 times)

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