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第六章 核酸化学 Nucleic acid - PowerPoint PPT Presentation


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第六章 核酸化学 Nucleic acid. 第一节 概述. 核酸 (nucleic acid) 以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,携带和传递遗传信息。 DNA ( D eoxyribo n ucleic a cid) 脱氧核糖核酸 RNA ( R ibo n ucleic a cid) 核糖核酸. 一、核酸的发现和研究工作进展. 1868 年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取“核素” 1944 年 Avery 等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson 和 Crick 发现 DNA 的双螺旋结构

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第一节 概述

核酸(nucleic acid)

以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,携带和传递遗传信息。

DNA(Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸

RNA(Ribonucleic acid) 核糖核酸


一、核酸的发现和研究工作进展

  • 1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”

  • 1944年Avery等人证实DNA是遗传物质

  • 1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构

  • 1966年 Nirenberg发现遗传密码

  • 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶

  • 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法

  • 1985年 Mullis发明PCR 技术

  • 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)

  • 1999年 中国加入人类基因组计划

  • 2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架

  • Post-genome era/OMICS era


二、核酸的分类及分布、功能

90%以上分布于细胞核,其余分布于核外如线粒体,叶绿体,质粒等。

脱氧核糖核酸

(deoxyribonucleic acid, DNA)

携带遗传信息,决定细胞和个体的基因型(genotype)。

核糖核酸

分布于胞核、胞液。

(ribonucleic acid, RNA)

参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。



一、元素组成

  • 主要元素组成: C、H、O、N、P(9~11%)

  • 与蛋白质比较,核酸一般不含S,而P的含量较为稳定,占9-11%。

二、基本构成单位:核苷酸(nucleotide)

核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成


戊 糖 (pentose)


1.碱基(base)




嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系,在紫外区有吸收(260 nm左右)。


2. 核苷 (nucleoside)

糖与碱基之间的C-N键,称为C-N糖苷键。

核糖核苷:AR, GR, UR, CR

脱氧核苷:dAR, dGR, dTR, dCR


3. 核苷酸(ribonucleotide)

核苷和磷酸以磷酸酯键连接


稀有核苷酸

核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多,大部分是上述碱基的甲基化产物。


1、核苷酸的组成:含氮碱基、戊糖和磷酸。

2、稀有核苷酸:稀有碱基/核苷/核苷酸

3、核苷酸的其他形式

  • 多磷酸核苷(NDP、NTP)

  • 环化核苷酸(cAMP、cGMP等)

  • 辅酶或辅基(NAD、NADP、FAD、CoA等,均含有AMP)

  • 活性代谢物(UDPG、CDP-胆碱等)


ATP

  • ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。

  • ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。


cAMP和cGMP

  • cAMP(3’,5’-环化腺苷酸)和cGMP(3’,5’-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。

  • cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4, cAMP和cGMP的水解能约为43.9 KJ/mol,比ATP水解能高得多。



一、一级结构(primary structure)

一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。

1、核苷酸的连接方式: 3, 5磷酸二酯键

2、核酸的基本结构形式:多核苷酸链

  • 信息量:4n

  • 末端: 5’端、 3’端

  • 多核苷酸链的方向: 5’→3’

3、表示方法:结构式、线条式、文字缩写


DNA双螺旋结构的研究背景

  • 碱基组成分析——Chargaff 规则:[A] =[T];[G] [C]

  • 碱基的理化数据分析:A-T、G-C以氢键配对较合理

  • DNA的X-线衍射图谱分析


二、DNA的空间结构

1. DNA的二级结构(secondary structure)

(1) 碱基组成规则(Chargaff规则)

  • [A]=[T],[G]=[C];

    [A]+[G]=[T]+[C](嘌呤与嘧啶的总数相等)

  • 有种属特异性

  • 无组织、器官特异性

  • 不受年龄、营养、性别及其他环境等影响


(2) DNA双螺旋(double helix model)结构要点

  • DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕,形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反,即其中一条链的方向为5′端→3′端,而另一条链的方向为3′端→5′端。


嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成90°角。


螺旋横截面的直径约为嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成2nm,每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm,每10个核苷酸形成一个螺旋,其螺矩(即螺旋旋转一圈的高度)为3.4 nm。

34Å


维持两条嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合,G与C结合,这种配对关系,称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键,G与C之间形成三个氢键。

在DNA分子中,嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。


  • 螺旋表面形成大沟嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成(major groove)及小沟(minor groove),彼此相间排列。小沟较浅;大沟较深,是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。

  • 氢键维持双链横向稳定性,碱基堆积力维持双链纵向稳定性。


  • 其他螺旋形式嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

  • Z-DNA(左手双螺旋)

  • A-DNA


3 dna
(3)DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成双螺旋的稳定性

DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。

维持这种稳定性的因素包括:两条DNA链之间形成的氢键,碱基堆积力。

双螺旋结构内部形成的疏水区,消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响;

介质中的阳离子(如Na+、K+和Mg2+)中和了磷酸基团的负电荷,降低了DNA链之间的排斥力等。

改变介质条件和环境温度,将影响双螺旋的稳定性。


  • 天然存在的嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成DNA分子最显著的特点是很长,分子质量很大,一般在106~1010。

  • 大肠杆菌染色体由400万碱基对(basepair,bp)组成的双螺旋DNA单分子。其长度为1.4×106nm,相当于1.4mm,而直径为20nm,相当原子的大小。

  • 黑腹果蝇最大染色体由6.2×107bp组成,长2.1cm

  • 多瘤病毒的DNA由5100bp组成 ,长1.7mm


2 dna
2.DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的三级结构

双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括:线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等


10nt/嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成圈为能量最低状态,<10时形成右手(负)超螺旋;>10时形成左手(正)超螺旋。

连环数 (L):一条链绕另一条链缠绕次数

扭转数 (T):DNA双螺旋圈数

超螺旋数 (W):超螺旋数

L=T+W


3. DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成在真核生物细胞核内的组装

核小体(nucleosome): 由DNA和组蛋白构成。

  • 组蛋白核心---八聚体H2B ,H2A ,H3 ,H4

  • DNA:以左手螺旋缠绕在组蛋白上---1.8圈(146 bp)

  • H1组蛋白在核小体之间的连接DNA上(54bp)


DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的存在形式---染色质(体)

5 fold

6 fold

40 fold

7 fold


4 dna
4. DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的功能

DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息,并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础,也是个体生命活动的信息基础。

基因从结构上定义,是指DNA分子中的特定区段,其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。


三、嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成RNA的分子结构


1 rna
1. RNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的结构特点

RNA是单链分子,因此在RNA分子中,嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。

RNA分子中,部分区域也能形成双螺旋结构,不能形成双螺旋的部分,则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。

在RNA的双螺旋结构中,碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外,也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA, 其二级结构有明显的差异。

tRNA中除了常见的碱基外,还存在一些稀有碱基,这类碱基大部分位于突环部分.


2. 嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成信使RNA的结构与功能

(1) 真核生物mRNA的结构特点

  • 大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷,同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化,形成帽子结构:m7GpppNm-。

  • 2. 大多数真核mRNA的3´末端在转录后加上一多聚腺苷酸(polyA)结构(20-250nt)。


  • 帽子结构和嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成多聚A尾的功能

  • mRNA核内向胞质的转运

  • mRNA的稳定性维系

  • 翻译起始的调控


(2)嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成真核生物mRNA成熟过程

hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)

Eukaryote

Polycistronic mRNA

Prokaryote


细胞质嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

真核细胞

细胞核

内含子

外显子

DNA

原核细胞

DNA

转录

转录

mRNA

hnRNA

转录后剪接

转运

翻译

蛋白

mRNA

翻译

蛋白

(3)mRNA的功能

把DNA所携带的遗传信息,按碱基互补配对原则,转录并传送至核糖体,用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。


3 trna
3. tRNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的结构与功能

(1) tRNA的一级结构特点

含 10~20% 稀有碱基,如 DHU

3´末端为 - CCA-OH

5´末端大多数为G

具有 TC

次黄嘌呤(I)

假尿嘧啶()

双氢尿嘧啶(DHU)


3`嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成末端的CCA-OH单链用于连接该tRNA转运的氨基酸

(2) tRNA的二级结构

-----三叶草形

  • 氨基酸臂

  • DHU环

  • 反密码子环:

  • 额外环

  • TΨC环

IV

I

III

核糖体识别结合位点

识别氨酰-tRNA合成酶

II

与mRNA的三联体密码互补配对,称为反密码子(anticodon)


(2) 嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成tRNA的三级结构

-----倒L型


(3) 嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成tRNA的功能:

活化、搬运氨基酸到核糖体,参与蛋白质的合成。


4. rRNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的结构与功能

(1)rRNA的功能:

组成核蛋白体,作为蛋白质合成的场所。

核糖体的组成


5. 嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成其他小分子RNA

除了上述三种RNA外,细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA,统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs),或非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA, ncRNA) 。

  • 种类:核内小RNA;核仁小RNA;胞质小RNA;催化性小RNA;小片段干涉 RNA

  • 功能:参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此,有人也将其称为调节RNA(regulatory RNA)。


  • 小片段干扰嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成RNA (siRNA):一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference,RNAi,也译作RNA干预或干涉)。


RNAi嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的作用机制:

1)在起始步骤,生物宿主将外源基因表达的双链RNA进行切割,产生具有特定长度(19-21nt)和序列的小片段siRNA;

2)siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物(RISC)。RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA。


第四节 核酸的理化性质嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成


一、核酸的一般理化性质嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

1、DNA白色纤维状固体,RNA白色粉末状固体,都微溶于水,不溶于乙醇,因此常用乙醇来沉淀DNA ; DNA溶液黏度大于RNA ;

2、 DNA难溶于0.14mol/L的NaCl溶液,可溶于1~2 mol/L的NaCl溶液,RNA则相反,可据此分离二者;

3、特征颜色反应

D-核糖+浓盐酸+苔黑酚 绿色;

D-2-脱氧核糖+酸+二苯胺 蓝紫色


4嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成、两性解离:核酸含酸性的磷酸基团,又含弱碱性的碱基,为两性电解质,可发生两性解离;核酸相当于多元酸,pI 1~2。


二、核酸的水解嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

1、酸水解

糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解;嘌呤糖苷键酸中最易被打开

2、碱水解

糖苷键比磷酸酯键更易发生酸水解;由于RNA中2‘-OH参与形成环磷酸酯,RNA更易发生碱水解


3嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成、酶水解

  • 核酸酶的分类

底物:核糖核酸酶(RNase),脱氧核糖核酸酶(DNase)

作用方式:内切酶和外切酶

磷酸二酯键断裂方式:


Py Pu Py Py Pu Py嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

  • 核糖核酸酶类

牛胰核糖核酸酶 (RNase I)

作用位点:嘧啶核苷-3’-磷酸与其他核苷酸间的连键

核糖核酸酶 T1(RNase T1)

A G U G C A

作用位点:3’鸟苷酸与其他核苷酸5‘-OH的连键


EcoR I嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

Enzyme number

E. coli

strain

  • 脱氧核糖核酸酶类

牛胰脱氧核糖核酸酶 (DNase I)

将dsDNA或ssDNA切成5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸

限制性内切酶 (restriction endonuclease)


三、紫外吸收嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

  • 最大吸收波长:260nm

  • 核酸定量分析

  • 核酸定性分析


OD嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成260的应用

  • 1. DNA或RNA的定量

    • OD260=1.0相当于

      • 50μg/ml双链DNA

      • 40μg/ml单链DNA(或RNA)

      • 20μg/ml寡核苷酸

  • 2.判断核酸样品的纯度

    • DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8

    • RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0


四、变性、复性、分子杂交嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

1、DNA变性(DNA denaturation)

DNA变性是指在理化因素作用下,DNA分子中的氢键断裂,碱基堆积力遭到破坏,双螺旋结构解体,双链分开形成单链的过程。

方法:过量酸,碱,加热,变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。


  • DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成变性的本质是双链间氢键的断裂,一级结构不变

  • 变性后其它理化性质变化:OD260增高;粘度下降;比旋度下降;浮力密度升高;酸碱滴定曲线改变;生物活性改变


嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成1)增色效应:DNA变性时其溶液OD260增高的现象。


嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成2)DNA的热变性

当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时,双螺旋结构即发生解体,两条链彼此分开,形成无规线团。

  • 融解温度(melting temperature, Tm):DNA热变性过程中,紫外吸收达到最大值的一半时溶液的温度称为融解温度(Tm)或解链温度、变性温度。


影响嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成Tm值的因素

  • 离子强度


  • DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的性质和组成: GC含量越高,Tm越大

在pH7.0, 0.165 mol/L NaCl溶液中

(G+C)% =(Tm-69.3)×2.44


2. DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成复性

  • DNA复性(renaturation)的定义: 在适当条件下,变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象,这一现象称为复性。

  • 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,这一过程称为退火(annealing)。

  • 减色效应(hypochromic effect ): DNA复性时,其溶液OD260降低。


核酸分子杂交嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成(hybridization)

  • DNA复性过程中,如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中,只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对,在适宜的条件(温度及离子强度)下,可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种现象称为核酸分子杂交。


核酸分子杂交的应用嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成


第五节 核酸的研究方法嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成


一、核酸的分离提纯和定量测定嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

1. DNA的分离

真核生物中的染色体DNA常与碱性蛋白结合成核蛋白(DNP)形式存在于核内。

浓盐法:

用浓盐(1MNaCl)提取出DNP;

用氯仿/异丙醇,除去蛋白质;

冷乙醇沉淀出DNA;


  • 2. RNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的分离

  • 因为RNase无处不在而得RNA提取分离更为困难。

  • 所有玻璃器具都应高温灭菌,不能高温高压的用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理

  • 破碎细胞时使用强变性剂,如胍盐,使酶失活;

  • 在RNA反应体系内加入RNA酶的抑制剂;

  • 目前最常用的RNA制备方法有两个:

  • 1)用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提:少量制备RNA。

  • 2)用胍盐/氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心:大量制备RNA


3. 嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成核酸的定量测定

紫外吸收法

1个A~50μg/ml 双链DNA

~40μg/ml RNA或单链DNA

定糖法

RNA:核糖→ 糠醛 绿色物质(670-680nm)

DNA:脱氧核糖+二苯胺 兰色物质(595-620nm)

苔黑酚


定磷法嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

核酸含磷量为9.5%

1g磷相当于10.5g核酸

琼脂糖凝胶电泳

溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物

在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光

荧光强度与DNA含量成正比


二、核酸的沉降特性与超速离心嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),密度和沉降速率不同,用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来。

石蜡油

蛋白质

开环/线性DNA

环形DNA

超螺旋DNA或RNA


  • 核酸密度测定嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

8M CsCl,45000 rpm,16h

密度梯度:1.80g/ml→1.55g/ml

平衡时:浮力密度=CsCl密度=离心力

ρ=ρ0 +4.2ω2(r2 - r02) × 10-10

ρ0:标准DNA浮力密度

ρ :浮力密度(未知)

ω :角速度(弧度/秒)

r:样品到转轴的距离

G-C含量与DNA的浮力密度之间关系

ρ=0.1 xG-C + 1.658


三、核酸的凝胶电泳嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

琼脂糖凝胶电泳:用于大片段DNA的分离,精度低,但分离范围广;

聚丙烯酰胺凝胶电泳:小片段核酸分离


四、核酸的核苷酸序列测定嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

1.DNA的酶法测定

Sanger测定DNA核苷酸序列的方法:DNA合成终止法(双脱氧DNA链合成终止法)。


DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成序列分析仪:

四色荧光基团标记的dNTP


2. DNA嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成的化学法测序:

由Maxam和Gilbert所发明。

其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基,然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应,可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断,其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱


4嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成组特异的反应如下:

(1)G反应:用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化,加热引起鸟嘌呤脱落,多核苷酸链可在此处断裂

(2)G+A反应:用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化,从而使其糖苷键变得不稳定,再用哌啶使键断裂

(3)T+C反应:用肼使T和C的嘧啶环断裂,再用哌啶除去碱基

(4)C反应:当有盐存在时,只有C与肼反应,并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落,并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂


32嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成P *ACTTCGACAG

肼/NaCl(C):

*AC

*ACTTC

*ACTTCGA C

*ACTTCGACAG

肼(C+T):

*AC

*ACT

*ACT T

*ACTTC

*ACTTCGAC

*ACTTCGACAG

硫酸二甲酯(G):

*ACTTCG

*ACTTCGACAG

甲酸(G+A):

*A

*ACTTCG

*ACTTCGA

*ACTTCGACA

*ACTTCGACAG

从下往上读:CTACGTA,末端G不能读出。


五、聚合酶链式反应 嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成(PCR)

  • 1995年K.Mullis发明。基本步骤为:

  • 设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列,并尽量减少可能产生的非特异产物

  • 优化反应体系:包括适量模板、引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶和适量Mg2+

  • 选择3个温度进行热循环:变性94℃,45-60s;退火,根据引物的Tm ,1min;延伸,72℃,1min。循环

  • 扩增完成后取出一定量的反应产物,检测扩增结果:先进行凝胶电泳,用溴化乙啶染色,紫外光下检测结果


Thermal Cycler Steps嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧,磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直,糖基环平面与碱基环平面成

Denature

double-stranded DNA

Anneal

primers to single-stranded DNA

Extend primers,

yielding new double-stranded DNA

Cycling:Repeat

steps 1 through 3 (20 - 40 times)


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