1 / 66

La spermatogenèse et les souris mutant-t

La spermatogenèse et les souris mutant-t. -comment arriver à produire des millions de spermatozoïdes par jour -comment assurer que les gamètes sont égaux -les mutants où les gamètes ne sont pas égaux: une piste pour comprendre la spermatogenèse.

jaden
Download Presentation

La spermatogenèse et les souris mutant-t

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. La spermatogenèse et les souris mutant-t • -comment arriver à produire des millions de spermatozoïdes par jour • -comment assurer que les gamètes sont égaux • -les mutants où les gamètes ne sont pas égaux: une piste pour comprendre la spermatogenèse

  2. Analysis of male sterile mutations in the mouse using haploid stage expressed cDNA probes. Dudley K, Potter J, Lyon MF, Willison KR. Nucleic Acids Res. 1984 May 25;12(10):4281-93 Restricted expression of a zinc finger protein in male germ cells. Hosseini R, Marsh P, Pizzey J, Leonard L, Ruddy S, Bains S, Dudley K. J Mol Endocrinol. 1994 Oct;13(2):157-65.

  3. Les sujets abordés1. L’importance de l’apoptose2. Comment étudier la spermatogenèse3. Le décalage entre la transcription et la traduction4. Les empreintes génomiques5. L’inactivation du chromosome XQuels sont les étapes moléculaires essentielles pendant la production d’un spermatozoïde?

  4. Spermatogenèse • 15% de couples n’arrivent pas à avoir un enfant: 50% des problèmes proviennent des mâles. • La spermatogenèse dépend de 3 types de cellules • -cellules germinales • -cellules de Sertoli • -cellules de Leydig • La spermatogenèse est sous contrôle de 2 hormones: • -FSH agit sur les cellules de Sertolidifférentiation cellules germinales • -LH agit sur les cellules de Leydigtestosterone productionlibido, développement sexuel

  5. Régulation Hormonale

  6. Journal of Cellular and Molecular MedicineVolume 15, Issue 3, pages 468-483, 24 MAR 2011 DOI: 10.1111/j.1582-4934.2010.01242.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1582-4934.2010.01242.x/full#f3

  7. Spermatogenèse murine

  8. La differentiation des cellules germinales dépend des facteurs de transcription Journal of Cellular and Molecular MedicineVolume 15, Issue 3, pages 468-483, 24 MAR 2011 DOI: 10.1111/j.1582-4934.2010.01242.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1582-4934.2010.01242.x/full#f2

  9. Les tubules seminifères

  10. La structure des spermatozoïdesLes protéines Ropporin et Rhodolphin se trouvent dans le queue associés avecles microtubules et les G protéines ( Rho etc).

  11. Les malformations des spermatozoïdes

  12. L’apoptose: essentiel pour la production des spermatazoides Shaha C et al. Phil. Trans. R. Soc. B 2010;365:1501-1515 ©2010 by The Royal Society

  13. The pro- and anti-apoptotic molecules. Shaha C et al. Phil. Trans. R. Soc. B 2010;365:1501-1515 ©2010 by The Royal Society

  14. Spermatogenèse et l’apoptose Les cellules de Sertoli sont essentiels pour le développement des cellules germinales. -rapport nombre cellules Sertoli/nombre cellules germinales important Souris transgenique pour Bcl-2 ( anti-apoptotic) stérile Avec des souris non-transgenique: marquage avec anticorps Bax ( pro-apoptotic) montre un vague d’apoptose à 3 semaines. Le nombre de cellules germinales est réduit par 80% Le rôle des cellules de Sertoli est capital pour la spermatogenèse. Pas de système in vitro à cause de cette interaction très étroite

  15. Comment étudier la spermatogenèse? • Pas de système in vitro où on peut faire différencier les cellules germinales en spermatozoïdes • -purification des cellules sur les gradients de BSA • -Souris mutants ( Tfm, Sxr, Steel) • Steel: Pas de cellules germinales • Sxr: Spermatagonie • Tfm: Spermatagonie, 1° spermatocytes • -souris à des ages différents

  16. Développement poste natal des cellules germinales • Jours poste natal Cellules présentes • 0 jours Spermatogonie • 9 jours 1° Spermatocytes • 1st division méiotique • 18 jours 2° Spermatocytes • 2nd division méiotiquecellules haploides • 20 jours Spermatides rondes • 25 jours Spermatides allongés • 35 jours Spermatozoïdes

  17. L’expression de l’information génétique pendant la spermatogenèse • 1. Est-ce que les gènes continuent d’être exprimé après la méiose? • 2. Quel est le rôle des ponts cytoplasmiques qui existent entre les cellules germinales? • 3. Comment c’est possible d’avoir la différenciation des spermatozoïdes en même temps que l’empaquetage de l’ADN

  18. Criblage différentiel pour identifier les gènes qui s’expriment après la meiose • Banque ADNc de testicule de la souris adulte • ARN des testicules des souris de 2 semainessonde ADNc • ARN des testicules des souris de 3 semainessonde ADNc • Criblage de la banque avec les deux sondes • Identification des clones qui s’allument avec la sonde de 3 semaines mais pas avec la sonde de 2 semaines • Vérification des résultats par Northern blot

  19. Expression des gènes: la suite • Un nombre important de gène s’exprime pendant et vers le fin de la méiose • La majorité de ces gènes sont encore exprimés* dans les spermatids • Hypothèse: un ‘re-programming’ du génome pendant la méioseexpression des gènes essentiels pour la différentiation des spermatozoïdes. • Expression de beaucoup de gènes qui probablement n’ont pas de rôle important dans la vie des cellules germinales • Expression des nouveaux isoformes: e.g. Pgk-2, sur le chromosome X • Comment assurer que tous les spermatozoïdes sont ‘égaux’ si les gènes sont toujours exprimés après la meiose: • * Les transcrits sont présents

  20. Le rôle des ponts cytoplasmiques • Est-ce que les molécules peuvent traverser les ponts cytoplasmique? • Souris transgénique pour un gène qui code pour l’hormone de croissance sous contrôle du promoteur qui s’exprime fin de la méiose. Une copie intégré dans le génome. • +/tr méiosespermatides + et spermatides tr • Marquage avec un anti-corp ante-GH: GH présente dans toutes les cellules. • Soit la protéine peut traverser les ponts cytoplasmiques • Soit l’ARNm peut traverser les ponts cytoplasmiques • Soit les deux: in situ pour faire la différence? • En plus: la protéine AKAP4, protéine structurelle présente dans les spermatazoïdes, encodé sur le chromosome X est exprimé uniquement dans les cellules post-méiotique. • XY spermatides X et spermatides Y: il faut AKAP4 dans les deux. • L’ARNm en association avec TB-RBP ( testis-brain RNA binding protein) traverse les ponts cytoplasmiques

  21. Testis-Brain RNA Binding protein • ARNm en combinaison avec TB-RBP important pour empêcher la traduction et pour le transport dans les cellules germinales • Même problème chez certaines cellules neuronales • E.g. Les motoneurones: les ARN m sont produits dans le corps cellulaire, les protéines sont produites fin des axons, souvent très longs. TB-RBP doit assurer que ces ARNm ne sont pas traduits dans le corps cellulaire mais dans les projections cellulaires.

  22. Le démontage des nucléosomes pendant la spermiogenèse FEBS JournalVolume 277, Issue 3, pages 599-604, 15 DEC 2009 DOI: 10.1111/j.1742-4658.2009.07504.xhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1742-4658.2009.07504.x/full#f1

  23. La protamine • La protamine remplace les histones pendant l’empaquetage de l’ADN • Les transcrits du gène sont présents 20 jours après la naissance • La protéine est détectée 8 jours plus tard • Les séquences essentielles pour ce décalage sont dans le 3’UTR • Faire la transgenèse avec des transgènes chimères pour identifier les séquences • Expression précoce stérilité

  24. Décalage transcription/traduction • Chromatographie d’affinité pour trouver des protéines qui se fixent sur les 3’UTR • Protamine Binding Protein isolé. • Souris KO pour cette protéine: Regarde l’expression de transgène Prot-GH-3’UTRPr ( GH-Hormone de Croissance, pas exprimé normalement dans les cellules germinales). • Pas d’expression précoce et pas de traduction plus tard. • Modèle: contrôle en deux étapes: une protéine se fixe sur le 3’UTR pour empêcher la traduction. Le rôle de PBP est de déplacer cette protéine pour permettre la traduction

  25. Les chromosomes X et Y pendant la spermatogenèse • Crossing-over obligatoire pour les paires d’autosomes pendant la méiose: un check-point • Pareil pour les chromosomes X et Y: région pseudoautosomal sur les 2 chromosomes • La transcription des gènes sur le chromosome X arrête pendant la méiose, la transcription des autosomes continue • Peu de gènes sur le chromosome Y; sur le chromosome X beaucoup de gènes qui s’expriment au début de la spermatogenèse. • Fin de la spermatogenèse il faut que les protéines encodés par le chromosome X se trouvent dans toutes les cellules y compris la moitié qui manque le chromosome X • AKAP4: le déplacement des spermatozoïdes dépend de cyclic AMP et l’activité de cette molécule dépend des kinases. Les kinases se trouvent dans la structure des spermatozoïdes. AKAP4 est un gène sur le X qui assure la bonne distribution des kinases dans les spermatozoïdes • Les gènes sur le X sont de bons candidates pour les gènes à l’origine des problèmes de fertilité chez l’homme.

  26. Inactivation du chromosome X pendant la spermatogenèse • L’inactivation du chromosome X se fait chez les femelles • La réactivation du chromosome X se fait pendant la gamétogenèse chez les femelles • Le chromosome X est aussi inactivé pendant la gamétogenèse chez le mâle

  27. Les synapses se forment aussi entre le chromosome X et le chromosome Y dans la partie PAR ( pseudo-autosomal region). -Absence des synapses mène à l’arrêt de la méiose : système pour assurer que tous les chromosomes soient présents. -Le fait que l’appariement entre le X et le Y est partiel est probablement la raison pour lequel il faut inactiver  le X

  28. Le gène Xist s’exprime pendant la spermatogenèse mais les souris où Xist est inactivé peuvent toujours inactivé le X • Pas d’expression des ARNm à partir du chromosome X inactivé pendant la spermatogenèse (cf femelle) • Par contre 67 sur 77 miRNA sont exprimés après l’inactivation du X. • Les miRNA pourrait jouer un rôle dans l’inactivation. • les miRNA sont essentiels pour la mise en place de la heterochromatinisation du X et • B) les miRNA sont impliqués dans la régulation de l’expression des ARNm qui codent pour les protéines essentiels pour MSCI.

  29. Les mi-RNA et la régulation post-transcriptionnel

  30. miR-469 et la régulation de la traduction des ARNm de la Protamine et les Transition Proteins • Les souris KO pour GRTH (Gonadotropin-regulated testicular RNA helicase) sont stériles: absence de la production de plusieurs protéines essentielles pour la spermatogenèse • Les souris KO pour GRTH ont une expression plus élevée du miR-469 • Les séquences reconnues par miR-469 sont présentes dans la partie codante des ARNm de Protamine et Transition Proteins • Modèle: miR-469 s’exprime et se fixe sur les ARNm pour empêcher leur traduction. GRTH empêche l’expression de miR-469 et les ARNm peuvent être traduits. • L’action des mi-RNA dépend du site où ils lient l’ARN: partie codanteempêche la traduction. Non-codantedegradation

  31. Les gènes avec les empreintes génomiquesUn nombre de gène important s’exprime uniquement à partir du chromosome maternel ou chromosome paternelLes empreintes sont établis pendant la gametogenèse

  32. Y-Box protéines: un lien entre la transcription et le décalage de la traduction • Y-box proteins: famille de protéines qui se fixent sur l’ARN et l’ADN • MSY2: 0,7% de la protéine totale dans les cellules germinales: présente dans le noyau et le cytoplasme • In vitro l’interaction entre MSY2 est les ARNm est non-spécifique Par contre immunoprécipitation des ARNm sous forme de polyribosomes montre que la majorité des ARNm qui fixe MSY2 ne sont pas dans les polyribosomes ( donc subissent un contrôle niveau de la traduction).

  33. Y-box proteins-suite . Les gènes qui codent pour les ARNm qui fixent le MSY2 contiennent un MSY2 site dans leur promoteur . Transgèniques: Promoteur SP10, avec ou sans site MSY2, avec GFP. MSY2 site dans le promoteurARNm n’est pas présent dans les polyribosomes. • La protéine MSY2 se fixe sur le promoteurla transcriptionMSY2 se fixe sur le transcrit. • KO du gène MSY2-transcription, épissage normal mais des transcrits normalement absents des polyribosomes sont présents. • Les souris sont stériles: l’absence de décalage transcription/traduction mène à la production de protéines trop tôt pendant la spermiogenèse

  34. Spermatogenèse murine

  35. Le complèxe-t de la souris • 1% du génome de la souris, sur le chromosome 17 • Présence des gènes qui touchent à: • -le crossing over • -le développement des embryons • -la fertilité des souris mâles ( mais pas les femelles) • Les informations qui proviennent de ces expériences ont: • -donné des nouvelles idées sur la base de la fertilité mâle • -montré comment les mutations défavorables pour un individu peuvent être favorable pour une population

  36. L’organisation du complèxe-t

  37. Clonage de Tcp-1 et Tcp-11 • Cell 14, 44-56 1986 • Molecular cloning and sequence analysis of a haploid expressed gene encoding t complex polypeptide 1 • Keith R. Willison, Keith Dudley and Jean Potter Chester Beatty Laboratories Institute of Cancer Research Fulham Road, London SW3 6JB, UK Mech Dev. 1994 Jul;47(1):73-80. • The mouse t-complex gene, Tcp-11, is under translational control. • Hosseini R, Ruddy S, Bains S, Hynes G, Marsh P, Pizzey J, Dudley K. • Developmental Biology Research Centre, Randall Institute, King's College, London, UK. • Bioessays. 1999 Apr;21(4):304-12. Links • New insights into the t-complex and control of sperm function. • Fraser LR, Dudley K. • Anatomy and Human Biology Group and Developmental Biology Research Centre, London, United Kingdom. lynn.fraser@kcl.ac.uk

  38. La mutation tufted tf

  39. TRD Chromosome 17

  40. TRD

  41. Haplotypes partiels • La recombinaison entre les t-chromosomes et les chromosomes sauvages est réduite dans la région du complèxe-t • Les crossing-overs qui ont lieu donnent des haplotypes partiels avec une partie de la région du complèxe-t dans le forme t • On peut utiliser les haplotypes partiels pour identifier les régions qui contiennent les distorters et les responders • Les haplotypes partiels sont connus par les gènes létales

  42. Distorters et Responder des t-mutants

  43. TRD

  44. Late mating experiments L’accouplement se fait vers minuit juste après la libération des ovocytes: la fécondation se fait quand l’ovocyte est encore haut dans le système reproductif On mettant le mâle avec la femelle plus tard ( vers 04H00) la fécondation se fera quand l’ovocyte est déjà descendu une partie des trompes utérine.  TRD peut être réduit ou éliminé Deux possibilités: -en réduisant la distance nagé par les spermatozoïdes les spermatozoïdes t ne sont plus supérieur -en réduisant la distance on réduit le temps que les spermatozoïdes passent dans les trompes utérines

  45. Spermatazoide t v spermatazoide +Course à la nage • Accouplement entre une souris mâle t/+ et une femelle +/+ • 4 heures après l’accouplement isole les trompes uterines et les couper en tranches • Isoler les spermatazoides, isoler l’ADN • Southern blot avec une sonde qui donne une polymorphism • En bas des trompes: + = t • Milieu des trompes: t>+ • Haut des trompes: t>>+ • Fort probable que les t nagent plus vite que les +

  46. TRD: Mâle t/+ x femelle +/+  95% t/+ 5% +/+ Fécondation avec des spermatozoïdes provenant de 2 mâles différents Mâles t/+ et +/+ x femelle +/+  50% t/+ 50% +/+ Les spermatozoïdes t sont supérieurs par rapport aux partenaires méiotique mais ne sont pas supérieurs par rapport aux spermatozoïdes provenant des souris sauvage. Conclusion: les cellules germinales portant le chromosome t peuvent endommager les cellules germinales sauvages Mixed inséminations

  47. Identification des gènes et des protéines impliqués dans le TRD • 1. Analyse des protéines dans les cellules germinales des souris sauvages et t. Par gel en 2 dimensions 10 protéines polymorphiques. • 2. Séparation des cellules germinales pour voir dans quelles cellules les protéines s’expriment. • 3. Criblage des banques de spermatids etc. 4. Localisation des gènes avec des haplotypes partiels: •  candidats pour les distorters et responder • 5. Micro-dissection des chromosomes avec des translocations • 6. Analyse des banques de données

  48. Identification du gène responder • Un gène qui est candidat pour le responder doit: • -se trouve dans la bonne région génomique • -s’exprime dans les cellules germinales • -être polymorphique ( niveau séquence ou expression) entre les souris t et les souris + • -agir comme un responder chez des souris transgèniques

More Related