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DNA 限制性内切酶消化

DNA 限制性内切酶消化. 实验原理. 限制性内切酶： 识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同 DNA 片段可连接起来形成重组 DNA 分子，故 DNA 限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 影响酶活性的因素有很多，温度、 pH 值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性. 实验原理. 每种酶有其最适的缓冲体系（低盐、中盐、高盐等） 单酶切反应 双酶切反应. 酶反应体系：. 底物 DNA 限制性内切酶： 1-5U/ μgDNA pH TRis-HCl 缓冲液 小牛血清白蛋白 NaCl 温度 :37 ℃

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DNA 限制性内切酶消化

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Presentation Transcript

  1. DNA 限制性内切酶消化

  2. 实验原理 • 限制性内切酶：识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组DNA分子，故DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 • 影响酶活性的因素有很多，温度、pH值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性

  3. 实验原理 • 每种酶有其最适的缓冲体系（低盐、中盐、高盐等） • 单酶切反应 • 双酶切反应

  4. 酶反应体系： • 底物DNA 限制性内切酶：1-5U/μgDNA pH TRis-HCl缓冲液 小牛血清白蛋白 NaCl 温度:37℃ 时间：1-2h

  5. 实验步骤 pBR322 2 μl PstⅠ 2 μl EcoRⅠ 2 μl 10×Buffer 2 μl ddH2O 12 μl 总体积20 μl 封口膜封口, 瞬时离心 37℃ 水浴，2h 冰水浴 65℃ 加热灭活终止反应

  6. DNA琼脂糖凝胶电泳 • 原理： 琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。 • 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏

  7. 溴化乙锭为ＤＮＡ荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254 ～365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.5～1μg.

  8. 线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系

  9. 实验步骤 ⒈琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度0.5μg/mL ⒉凝胶板的制备 ⒊上样 ⒋电泳 电压10v/cm,溴酚蓝移出2/3的距离时，取出凝胶紫外灯下观察结果

  10. 实验结果

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