Gen tica molecular em an lises clinicas
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Genética Molecular em Análises Clinicas. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos. PCR Real Time PCR NASBA/TMA. PCR. OPTIMIZAÇÃO DO PCR. [MgCl 2 ] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores]. Variações. RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR.

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Genética Molecular em Análises Clinicas

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Presentation Transcript


Gen tica molecular em an lises clinicas

Genética Molecular em Análises Clinicas

TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Prof.Doutor José Cabeda


T cnicas de amplifica o de cidos nucleicos

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

  • PCR

  • Real Time PCR

  • NASBA/TMA


Gen tica molecular em an lises clinicas

PCR


Optimiza o do pcr

OPTIMIZAÇÃO DO PCR

  • [MgCl2]

  • Th

  • [dNTP]

  • [primers]

  • [DNA]

  • [inibidores]


Varia es

Variações

  • RT-PCR

  • Multiplex PCR

  • Nested PCR


T cnicas de amplifica o de cidos nucleicos1

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

  • PCR

  • Real Time PCR

  • NASBA/TMA


Principio de funcionamento do real time pcr

Principio de funcionamento do Real-Time PCR

Prof.Doutor José Cabeda


Detec o dos produtos de pcr

Detecção dos produtos de PCR


Montar uma reac o

Montar uma reacção


Qu micas utiliz veis

Químicas Utilizáveis

Prof.Doutor José Cabeda


Detc o com sybgreen

Detcção com SybGreen


Sybr green detection

Sybr-Green Detection

  • Intercalates to dsDNA

  • Inhibits DNA amplification so concentration is critical

  • Detects specific and non-specific targets

  • Low starting background with large increase in signal

  • Can run a melt curve to look at product specificity


Detec o com sondas

Detecção com sondas


Quimicas utiliz veis sondas taqman

Quimicas utilizáveis:sondas taqman


Quimicas utiliz veis molecular beacons

Quimicas utilizáveis:molecular beacons


Quimicas utiliz veis sondas fret

Quimicas utilizáveis:sondas FRET


Gen tica molecular em an lises clinicas

Transfer

Excitation

Emission

Hyb-ProbesTM

Oligo 1: Fluorescein

Oligo 2: Quencher

Prof.Doutor José Cabeda


Quimicas utiliz veis mgb probes

MGB

MGB

F

F

F

F

F

Q

Q

Q

Q

Quimicas utilizáveis:mgb-probes


Aplica es

Aplicações

Quantificação

Prof.Doutor José Cabeda


End point versus real time

End Point versus Real-Time


Quantifica o

Quantificação


Aplica es1

Aplicações

Detecção de Mutações / SNP

Prof.Doutor José Cabeda


Detec o de muta es

Detecção de mutações


Aplica es2

Aplicações

Multiplex Detection

Prof.Doutor José Cabeda


Detec o simult nea de v rios produtos

Detecção simultânea de vários produtos


Os equipamentos

Os equipamentos

Prof.Doutor José Cabeda


Light cycler

Light Cycler


Smartcycler

Smartcycler


Rotorgene

Rotorgene

  • The samples spin continually during a run at 500 rpm

  • The samples are heated and cooled in a low mass air oven

  • Tubes are illuminated as they pass the detector

  • On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample

  • Four Channels

    • Ch1: ex 470nm, det 510nm

    • Ch2: ex 530nm, det 550nm

    • Ch3: ex 585nm, det 610nm

    • Ch4: ex 625nm, det 660nm


Near patient testing

Near-patient-testing


T cnicas de amplifica o de cidos nucleicos2

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos

  • PCR

  • Real Time PCR

  • NASBA/TMA


Nasba nuclisens

NASBA/NUCLISENS


Amplification schematic diagram

Amplification: schematic diagram

Primer 1

Legend:

Reverse Transcriptase

  • sense RNA

  • antisense RNA

  • sense DNA

  • antisense DNA

RNase H

Primer 2

Reverse Transcriptase

T7 RNA polymerase

Primer 2

Reverse Transcriptase

Reverse Transcriptase

RNase H

Primer 1


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