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生物化学基本实验技能训练（二）

生物化学基本实验技能训练（二）. 721E 型分光光度计的原理和使用方法. 医学院生物化学教研室. 实验目的. 1 、掌握 721E 分光光度计的原理、结构与操 作方法 2 、学习末知溶液的浓度测定方法 3 、制作 CuSO 4 标准曲线，求得未知 CuSO 4 溶液的浓度. 主要内容. 分光光度法的原理 吸光度的测量 定量分析方法 721E 分光光度计的操作方法 721E 分光光度计操作练习. 分光光度法. 问题： 如何测定溶液中某一种物质的浓度？ 提示 ( 酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等 )

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生物化学基本实验技能训练（二）

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  1. 生物化学基本实验技能训练（二） 721E型分光光度计的原理和使用方法 医学院生物化学教研室

  2. 实验目的 1、掌握721E分光光度计的原理、结构与操 作方法 2、学习末知溶液的浓度测定方法 3、制作CuSO4标准曲线，求得未知CuSO4溶液的浓度

  3. 主要内容 • 分光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习

  4. 分光光度法 • 问题：如何测定溶液中某一种物质的浓度？ • 提示(酸碱滴定、氧化还原、络合滴定、沉淀等) • 光分析：经历了目视比色、光电比色和分光光度法几个不同阶段。 • 分光光度法：利用溶液对单色光的吸收度来确定溶液中有色物质的含量 • 有色物质溶液颜色的深浅与其浓度有关，浓度愈大，颜色愈深

  5. 图1－1 电磁波谱 光的基本性质 • 光是一种电磁波，具有波动性和微粒性。 • 波长(λ)、频率(υ)和光速(c)之间的关系是 υ=c/λ • 电磁波谱图 • 可见光区：波长范围约为380~760nm • 近紫外光：280~380nm

  6. 溶液的颜色 • 当白光通过某一溶液时，该溶液会选择性地吸收某些波长光而让那些未被吸收的光透射过去，溶液呈现透射光的颜色。 • 被吸收的光与透射过去的光称为互补色光

  7. A λ(nm) 图1-2 KMnO4溶液的吸收曲线 • 吸收曲线 • 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一条吸光度随波长变化的曲线，称之为吸收曲线或吸收光谱。 • 光吸收程度最大处的波长，称为最大吸收波长，常用λmax表示。 • 在正常情况下，选用不同浓度的某种溶液，最大吸收波长是固定不变的。 应用： • 可作为物质定性、定量分析的依据

  8. 散射光 入射光Io 透射光It 吸收光Ia 反射光 光吸收的基本概念 • 条件：一束平行单色光照射到均匀的、非散射的溶液时 • I0=Ia+Ir+It • I0为入射光强度 • Ia为吸收光强度 • Ir为反射光强度 • It为透射光强度

  9. 透光率与吸光度 • 透光率(Transmittance， T) • T=It/I0×100％ • 透光率的变化范围：0-100% • 吸光度(absorbance，A)： • 透光率的负对数，又称为光密度(Optical density，OD) • A= -lgT= lg(I0/It) • 吸光度的变化范围： 0 - ∞

  10. Lambert定律（1760年）：A=k1L Beer定律（1852年）： A=k2C 光吸收基本定律 • Lambert-Beer定律 条件：单色光，稀溶液 A=kLC Lambert-Beer定律： 吸光度 （Absorbance） 溶液浓度 液层厚度 吸光系数 • 吸光系数是物质的特征性常数

  11. 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习

  12. 钨丝灯 光源 氢灯或氘灯 棱镜 可见光 单色器 紫外光 光栅 玻璃 吸收池（比色杯、比色皿） 石英 可见光 光电管 紫外光 检测器 光电倍增管 检流计 显示器 数码管显示 分光光度计 仪器结构：

  13. 分光光度计的误差 • Lambert-Beer定律偏离的原因 • 物质浓度太高，改变了被吸收光的折射率 • 仪器的局限性 • 入射光的波长不纯；杂散光的干扰；光电检测器的疲劳现象 • 非对称的化学平衡 • 因其浓度、pH、溶剂和温度的改变，发生解离、缔合、溶剂化和互变异构等化学变化而发生偏离。

  14. 测量条件的选择 • 入射光波长 • 一般选用被测物质溶液的λmax。可以获得较高的灵敏度 • 控制适当的吸光度测量范围 • 最小误差出现在T%=20-65% (A=0.2 -0.7)的范围内 • 选择适当的参比溶液

  15. 参比溶液的选择 1、溶剂参比 • 当被测试液、显色剂及其他试剂在测定波长处都无吸收时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比溶液。 2、试剂参比 • 当被测试液无吸收，而显色剂或其他试剂在测定波长处有吸收时，可用不加试样的“试剂空白”作参比溶液。 3、试样参比 • 若被测试液本身在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收时，可用不加显色剂等的“试样空白”作参比溶液。

  16. 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习

  17. 定量分析方法-1 • 标准对照法 • 根据Lambert-Beer定律得： As=abcs Ax=abcx • 标准对照法的优缺点

  18. 定量分析方法-2 • 标准曲线法 • 配制一系列不同的已知浓度的测定物溶液，按测定管同样处理显色，分别读取各管吸光度； • 以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 • 测定时每一个浓度至少应同时做三管（平行管），取其平均值进行标准曲线的绘制。 Ax • 测定未知溶液的吸光度，直接从标准曲线上查得测定物的浓度。 Cx • 标准曲线法的优缺点

  19. 定量分析方法-3 • 摩尔吸光系数法 • 摩尔吸光系数ε是溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm的吸光度。 • 在已知ε的情况下(查文献)，读取测定液厚度为1cm时的吸光度，即可根据下式求得测定液的浓度。 • C=A/ε • 摩尔吸光系数法的优缺点

  20. 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习

  21. 721E分光光度计的结构 1．电源开关 2．“波长调节”旋纽 3．方式设定键 （MODE） 4. “100%T／0A”键 5．“0％T”键 6．比色皿架（样品 室） 7．比色皿架拉杆

  22. 功能键介绍 1．电源开关 2．“波长调节”旋纽：设置波长。360-760nm. 3．“MODE”键：设置测试方式：T与A 4． “0％T”键： • 将比色皿架处于“调零透射比”位置，调T为零。 5．“100%T／0A”键： • 使比色皿处于“参比样品”位，用于调整“T为100%”或“A为零”。 6．比色皿架：插放比色皿，有4个槽位。 7．拉杆：推或拉比色皿架拉杆，听到“咔嚓”声时，比色皿已置光路中。第一声“咔嚓”，表示比色皿处于“参比样品”位，第二声“咔嚓”， 表示比色皿处于“调零透射比”

  23. 仪器预热与调试 • 开机前，先确认仪器样品室内是否有东西挡在光路上。光路上有东西将影响仪器自检甚至造成仪器故障。 1．打开电源开关，使仪器预热20分钟。 2．用“波长调节”旋钮将波长设定在要使用的分析波长位置上。 3．盖好样品室盖。用“方式设定”键（MODE）改变测试为透光率（T）方式。 4．调“T=0”：用比色皿选择拉杆使比色皿槽处于“调零透射比”位置，在T方式下，按“0％T”键，调透光率为零。 5．调“T=100”，推或拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“参比样品”位置，按“100%T”调100%透射比。

  24. 样品测试 1．将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 • 拿放比色皿时应持其“毛面”不要接触“光面” • 比色皿内的溶液面高度不应低于2.5cm • 被测试的样品中不能有气泡和漂浮物 • 比色皿外的液体用滤纸吸干 2．打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别垂直插入比色皿槽中，盖上样品室盖 • 比色皿的“光面”要与光源在一条线上, 垂直放置 • 参比样品通常放在样品架的第一个槽位中 3．调“T=100”：将参比溶液推入光路中，用“MODE”键改变测试为“T”，按““100%T／0A”键调整T=100或A=0 • 仪器在自动调整过程中，显示器显示“BLA”，数秒后显示100。 4.调“T=0”：拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“调零透射比”位置，在T方式下，按“0％T”键，调T=0 5.重复步骤“3”和“4”，至“T=100”和“T=0”不再改变。 6. 按 “MODE”将测试方式设置为A方式 7．拉比色皿架拉杆，使比色皿槽处于“样品”位，仪器自动显示该样本的吸光度，记录数据。

  25. 吸光光度法的原理 • 吸光度的测量 • 定量分析方法 • 721E分光光度计的操作方法 • 721E分光光度计操作练习

  26. 721E分光光度计操作练习 • 已知CuSO4溶液的浓度5%，测定末知CuSO4溶液的浓度 • 方法 1、制作CuSO4标准曲线，测定未知CuSO4溶液的浓度 2、利用标准对照法测定

  27. Reagents & Materials • 5% CuSO4 • X% CuSO4 • dH2O • Test tubes • Pipettes • Spectrophotometer • Cuvette

  28. 实验操作 • 取6只试管，按右表操作 • 混匀，在波长650nm，用蒸馏水(参比溶液）校正零点。读取各管吸光度，记入右表。 方法一：以浓度为横坐标，吸光度为纵轴，绘制标准曲线。 • 读取未知浓度CuSO4溶液的光密度，从标准曲线上查出其浓度。 方法二：以任意一管为标准管，计算未知浓度CuSO4溶液的浓度。

  29. 1. 标准曲线法 2. Cuso4 (x%) 5ml , Ax Ax Cx X% CuSO4: Ax=? Cx=?

  30. =？ 2. 标准对照法 Calculation: 5%CuSO4 --- the standard, A标准=? x% CuSO4, A测定=?

  31. 讨论 • 比较两种不同方法得到的实验结果，分析误差产生的原因及减小措施。 • 思考题

  32. 下次实验 • 血清总蛋白与白/球比值的测定 • 书写预习报告，包括实验目的、原理、试剂等，实验步骤暂不写 • 第一、二、三组同学制作ppt并演讲 • 组长安排本次做清洁的同学

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