Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions
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Immobilized Hydrogels for Screening of Molecular Interactions. 罗戈. 相互作用组学的主要分析技术. 一、酵母双杂交系统 二、噬茵体展示技术 三、等离子共振技术 四、荧光能量转移技术 五、抗体与 蛋白 质阵列技术 六、免疫共沉淀技术 七、 pull-down 技术. 实验背景介绍.

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Presentation Transcript


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

Immobilized Hydrogels for Screening ofMolecular Interactions

罗戈


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

相互作用组学的主要分析技术

  • 一、酵母双杂交系统

  • 二、噬茵体展示技术

  • 三、等离子共振技术

  • 四、荧光能量转移技术

  • 五、抗体与蛋白质阵列技术

  • 六、免疫共沉淀技术

  • 七、pull-down技术


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

实验背景介绍

  • 对生物信息的快速评估是很必要的,但这也严重地依赖于对分子与分子,分子与细胞的相互作用的高通量检测。这个领域极大地增强了我们对分子和细胞过程的理解,该领域我们称之为微检测技术,日前已成为了分子生物学,药理学研究和临床诊断的重要技术之一。它为我们提供了大量在空间排列及高密度结构的生物学信息。

  • 目前大多数检测方法都主要是集中在某一组分和固体支持物的共价连结上,而这些方法既影响了分子或大分子的特性,也在表面产生了一些错误的分子作用,从而影响实验结果。为了消除这些影响因素,已开发出使用传统聚丙烯酰胺,底物荧光标记和自组装网络等解决策略。


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  • 今天,我们可以较容易地找到某种DNA、蛋白质或者小分子的检测方法,但是这些检测体系一般都受限于以下几种因素而使其分析结果不尽完美:一为检测基质与目标物质互补而形成的共价修饰(covalent modification of the target complement to the array substrate);二是检测及目标物质依赖性的反应条件(array- and target-dependent setup conditions);三是反应步骤太多(multiple steps);四是表面的失水作用(loss of hydration at the surface)等。


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

实验改进

  • 为了克服这些影响因素,本文设计、制备并评估了利用固定化水凝胶作为一般小室来检测小分子与蛋白质,蛋白质与蛋白质及核酸与核酸之间相互作用的方法。这种基于生物材料的方法具有简易,快速,单一步骤并可将目标互补物诱捕的优点,因此可在一定程度上改进传统的芯片技术。


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

水凝胶矩阵的构件类型

  • 底质基片主要有玻璃小片,硅胶片或聚合水凝胶等

  • 凝胶基质: 聚丙烯酰胺凝胶, 琼脂糖凝胶, 聚乙二醇凝胶,纤维素凝胶, 或溶胶-凝胶。


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水凝胶设计

  • 为了使每个在被醛基修饰的玻璃上的水凝胶小室获得更有效的信息。作者评估了一个二组分体系,其中包含四或八个氨基功能化的枝状大分子(如[G1]-Lys-NH2、[G2]-Lys-NH2、(Lys)2-PEG、(Lys)2 )2-PEG)和线性聚二醛及(CHO)2-PEG。(CHO)2-PEG可以与树状多肽大分子反应,形成锡氏夫碱和高度交联的水凝胶网络。


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

  • 通过测试,发现(Lys)2-PEG和(CHO)2-PEG体系最适宜作为检测的体系,因为其水凝胶小室可以适用于几乎所有的底物检测。

  • 同时水凝胶有几个良好的特性:高含水量,可控的物理性质,可作为生物及细胞反应的基质。


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

微矩阵芯片的制作

  • 对于水凝胶小室的制作,作者采用了OmniGrid AccentTM microarraying robot这种仪器,它含有一个微型点样针,可以将1-nL体积的水凝胶前体及印迹分子或大大分子点置醛基外被的玻璃表面上,利用这种点样技术,可以在18 X 72 mm玻璃表面上点出大约50000个水凝胶小室。从而达到了高通量的要求。


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实验一、小分子与蛋白质的相互作用

  • 制备了含生物素的水凝胶小室,然后用Cy5标记的抗生物素蛋白链菌素与小室结合。经过一段时间的杂交后, Cy5标记的抗生物素蛋白链菌素可成功地结合在含有诱捕生物素的水凝胶小室,并表现出特异性。其红色荧光强度是不含生物素小室的二倍。


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实验二、蛋白质与蛋白质的相互作用

  • 制备含山羊免疫球蛋白G(IgG)的水凝胶小室,用Cy5标记的蛋白G与小室杂交。其红色荧光的强度也是不含IgG的小室二倍多。也体现出该方法的特异性。


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二个对比实验

  • 目的;为了确定荧光强度的增强主要是蛋白质与蛋白质特异性识别的结果,而不是非互补蛋白的物理诱捕。

  • 1、含IgG的小室用Cy5标记的抗生物素蛋白链菌素进行杂交。

  • 2、含BSA的小室用Cy5标记的蛋白G进行杂交。

  • 结果:荧光强度未见明显增强。


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实验三、核酸与核酸的相互作用

  • 制备含反义RNA片段的水凝胶小室,用Cy5标记的互补RNA进行杂交。其荧光强度是非互补RNA强度的8倍之多,这充分体现出其特异性。

  • 进一步制备了含20个核甘酸的水凝胶小室,用Cy5标记的互补DNA进行杂交。其荧光强度是非互补RNA的5倍。也都表明了分子间特异性识别的作用。


Immobilized hydrogels for screening of molecular interactions

结论

  • 本文描述的扫描方法是利用位点独立的水凝胶小室来进行的生物学分析方法。在排除已往化学修饰及化学连联实体的情况下,通过检测特异的分子识别事件能够更容易地获得正确的结果。而且水凝胶小室也可以很容易的获得并可以达到高通量水平的要求,可以适用于各种分子之间相互作用的分析。不过这一技术也有一个潜在的限制因素,也就是水凝胶小室的绿色荧光背景,然而通过利用其他荧光染料,这一限制因素也可以很好地被弱化。

  • 总之,这种固定化水凝胶小室体系为我们研究基础生物过程提供了的解决办法,同时也为快速检测各种特异的分子与目标分子结合的疾病的诊断。


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谢谢


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