Le piante transgeniche
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Le piante transgeniche. Trasformazione genetica. Un processo mediante il quale un fenotipo di un organismo può essere cambiato attraversi l’aggiunta di DNA esogeno. L’organismo così generato è chiamato transgenico o Genetically Modified Organism (GMO).

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Le piante transgeniche

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Le piante transgeniche

Le piante transgeniche


Le piante transgeniche

Trasformazione genetica

Un processo mediante il quale un fenotipo di un organismo può essere cambiato attraversi l’aggiunta di DNA esogeno

L’organismo così generato è chiamato transgenico o Genetically Modified Organism (GMO)


Le piante transgeniche

Utilizzo e valore delle piante transgeniche

Agricoltura

  • Miglioramento genetico

  • miglioramento delle peformance

‘Farmaceuticals’ / ‘Neutraceuticals’

  • nuove colture per nuovi prodotti

  • piante ‘factories’ o ‘bio-reattori’

Ambiente

  • riduzione uso pesticidi

  • Bioremediation / phytoremediation


Le piante transgeniche

Modificazione delle piante: steps

  • Clonaggio (creazione della cassetta d’espressione del transgene)

  • Trasformazione (via Agrobacterium o altro metodo)

  • Selezione piante trasformate (uso di marcatori selettivi)

  • Screening del materiale con appropriata espressione genica

  • Isolamento delle linee omozigoti

  • test delle piante ottenute (analisi molecolari e d’espressione genica)


Le piante transgeniche

Modificazione delle piante: clonaggio

Gene reporter/selettivo

(es. Green Florescent Protein o

Resistenza ad antibiotici)

Gene d’interesse

(es. tolleranza ad erbicidi o

Resistenza a malattie)

Elementi controllo espressione

genica

(es. solo in foglia o in seme)


Le piante transgeniche

Generazione di piante Transgeniche

Agrobacterium tumefaciens

Microiniezione

Biolistico


Le piante transgeniche

Come vengono prodotte le piante transgeniche

Molto diffusa la trasformazione via Agrobacterium

  • Funzione per la maggior parte delle dicotiledoni e per alcune moncotiledoni

  • non necessita di attrezzature specifiche e può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio


Le piante transgeniche

L’ Agrobacterium: un ingegnere naturale

  • L’ Agrobacterium tumefaciens è un batterio del suolo che causa la formazione di tumori (crown gall) nelle piante

  • Contiene il plasmide Ti (Tumor-inducing plasmid)

  • Il plasmide Ti possiede una regione di DNA, il T-DNA (Transferred-DNA), che viene incorporato nel DNA nucleare della painta infettata


Le piante transgeniche

Ti Plasmid

T-DNA region

  • geni vir: essenziali per il trasferimento e l’integrazione della regione T-DNA

  • Auxine iaaM e iaaH : sintetizzano gli ormoni auxicini della crescita (acido indolacetico)

Cytokinin

Auxin

Opine

  • Citochinine - gene tmr (ipt): genera la citochinina trans-zeatina. Promuovono la crescita cellulare e la formazione delle galle

Left border

Right border

  • Opine: sono prodotti di reazioni di condensazione tra aminoacidi e keto acidi (es. nopaline, octopine, agropine). Sintetizzate e secrete dalle galle sono utilizzate come fonte di carbonio dall’Agrobacterium

12-24 kbp

Opine

catabolism

vir genes

ori


Le piante transgeniche

Manipolazione genetica del plasmide Ti

  • La delezione dei geni auxinici e delle citochinine elimina la formazione delle galle

  • Sono stati inseriti dei marcatori selettivi batterici di E. coli (selectable shuttle vector) al di fuori della regione T-DNA

  • Inserimento di marcatori selettivi per pianta all’interno della regione T-DNA

  • Qualsiasi gene viene inserito all’interno della regione T-DNA sarà incorporato nel DNA della cellula vegetale (es. geni di resistenza ad erbicidi)

  • Le cellule vegetali trasformate vengono rigenerate come pianta intera attraverso la coltura in vitro.

  • Ogni cellula della nuova pianta conterrà il transgene


Le piante transgeniche

Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale

Agrobacterium

Cellula vegetale

T-DNA

Nucleo

Ti plasmid


Le piante transgeniche

Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale

Cellula vegetale

ferita

T-DNA

Nucleo

Ti plasmid

Agrobacterium


Le piante transgeniche

Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale

Agrobacterium

Segnale di ferita

Cellula vegetale

T-DNA

nucleo

Copia di T-DNA a singolo filamento

(protetto da “ssDNA binding protein”)


Le piante transgeniche

Il Trasferimento del T-DNA da Agrobacterium a cellula vegetale

Agrobacterium

Segnale di ferita

Cellula vegetale

T-DNA

Nucleo

T-DNA

poro

Chromatina

Copia di T-DNA a singolo filamento

(protetto da “ssDNA binding protein”)


Le piante transgeniche

Rigenerazione delle piante

  • L’agrobatterio viene inoculato sul tessuto vegetale

  • Il tessuto viene messo in coltura in piastre contenenti un antibiotico selettivo

  • I calli (tessuti indifferenziati) vengono trasferiti in un altro mezzo di coltura contenete ormoni di crescita che inducono la formazione di germogli e/o radici

  • Si può effettuare un controllo dei calli trasformati prima della loro rigenerazione attraverso un’analisi molecolare (es. PCR)


Le piante transgeniche

Bombardamento con Microproiettili (biolistico)

  • Proiettili sferici di oro o tungsteno (0.4 – 1.2m dia.) vengono ricoperti con il DNA

  • Questi proiettili vengono sparati ad alta velocità (3-600 metri/sec) mediante un’apparecchiatura (particle gun) utilizzando aria compressa o gas compresso (elio)

  • Il proietticle penetra la parete cellulare e le membrane (trasformazione d cloroplasti o mitocondri)

  • Possono essere trasformate un gran numero di specie (anche monocotiledoni) che non sono suscettibili al trasferimento di DNA via Agrobacterium.

  • Questo metodo può essere utilizzato anche per sospensioni cellulari, colture di calli, tessuti meristematici, embrioni immaturi, coleoptili e polline.


Le piante transgeniche

Il transgene: RNA Antisenso

  • Questa tecnica viene utilizzata normalmente nelle piante per bloccare l’espressione di geni endogeni.

  • Frammenti clonati di geni vengono posti nel trasgene in orientamento inverso vicino ad un promotore.

  • Quando questo transgene antisenso viene reintrodotto nelle cellule vegetali previene in qualche modo la produzione della proteina endogena.

  • Non si ha un copleto knock-out del gene . Si può avere una debole o una maggiore produzione della proteina.


Le piante transgeniche

Alterazione della maturazione dei frutti mediante RNA Antisenso

  • La Poligalatturonase (PG) è un enzima che abbassa la pectina nelle pareti dei frutti in maturazione

  • Le piante transgeniche con PG antisenso (FLAVR SAVR tomato) producono poco PG. Le pareti si ammorbidiscono molto lentamente

Frutto Wild-type

Attività PG

Frutto PG Antisenso

  • Molti geni sono stati manipolati in modo analogo per rispordere ad alcune questioni basilari:

- qual’è il ruolo degli ormoni nella maturazione dei frutti?

- quali enzimi agiscono nella parete dei frutti ?

0

2

4

6

8

10

Giorni dal primo cambiamento del colore


Le piante transgeniche

Il transgene: RNAi

Una tecnica,che merita particolare attenzione, e che è stata introdotta solo di recente, è quella che permette di interferire con l’espressione di alcuni geni dannosi mediante la trasfezione di piccoli frammenti di RNA a doppio filamento in grado di antagonizzare l’RNA messaggero corrispondente (“ RNA INTERFERENCE”).La tecnologia dell’RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale, altamente specifico, presente in piante e animali, innescato da RNA a doppia elica (dsRNA) omologo alla sequenza del gene da sopprimere.

Diffusamente utilizzato in Caenorhabditis (nematode) – lavora anche in Drosophila, nei trypanosomi e in pianta


Le piante transgeniche

 In questo fiore un gene che controlla la produzione di pigmento viola è stato disattivato mentre il fiore era in crescita. Le cellule che si sono sviluppate dopo questo intervento risultano bianche in quanto I pigmenti viola non venivano più prodotti. Courtesy of Dr. Richard Jorgensen, University of Arizona.

RNAi


Le piante transgeniche

Il gene FLC quando viene silenziato produce precocemente I fiori in quanto la sua funzione è proprio quella di reprimere la fioritura. (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590).

Chalcone synthase gioca un ruolo nella formazione dei pigmenti in pianta. Il suo silenziamento produce semi giallo pallido (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590).

EIN-2 è un gene responsabile della percezione dell’etilene gene (Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590).

GUS è ilgene reporter molto utilizzato(Wesley et al., 2001, Plant J. 27: 581-590).

  • Phytoene desaturase è un gene che quandi viene silenziato forma piante bianche. Questo perchè I carotenoidi prevengono il fotosbiancamento della clorofilla.(Helliwell et al., 2002, Functional Plant Biology, 29: 1217-1225).

RNAi


Le piante transgeniche

Il transgene: Gene ‘stacking’ o ‘pyramiding’

Utilizzato già nel breeding tradizionale delle piante (“Gene stacking” è la combinazione attraverso l’incrocio e la selezione della pregenie di tratti desiderati in un’unica linea)

Biotecnologie : nuove strategie di co-espressione

  • Quando è necessario co-esprimere geni multipli

  • pathway biochemiche

  • enzimi multimerici

  • proteine multiple che controllano diversi ‘choke points’ nelle biosintesi

.


Le piante transgeniche

Miglioramento della tolleranza in pianta di stress abiotici

clima

Suolo

Temperatura (caldo, freddo)

Disponibilità di nutrienti

Idrico (siccità, asfissia)

Acidità e alcalinità

Stimoli meccanici (vento)

luce

troppa

poca

Inquinanti

Metalli pesanti

Ozono

Applicazioneprodottichimici

erbicidi


Le piante transgeniche

Erbicidi e problema delle infestanti

10% della perdita di produzione nelle colture è causata dale malerbe

> $10 billioni vengono spesi annualmente in erbicidi

  • Moltio erbicidi sono attivi contro le colture

    • - spesso devono essere distribuiti precocemente per precauzione

Molti erbicidi sono persistenti nel suolo o lasciano residui tossici

Il tillage (ploughing) può essere utilizzato per il controlllo delle malerbe ma può prvocare serie perdite d’acqua


Le piante transgeniche

Modalità d’ingegnerizzazione per tolleranza ad erbicidi

  • Esistono più di 100 diversi erbicidi con varie modalità d’azione

  • Molti erbicidi agiscono interferendo con enzimi chiave

  • Molti agiscono a livello di cloroplasti

  • Le piante variano nel loro livello di sensibiltà agli erbicidi. Alcune sono capaci di:

(a) Produrre enzimi che inattivano erbicidi particolari

(b) Produrre un target alterato di enzimi, insensibili a particolari erbicidi

(c) Inibire l’uptake dell’erbicida

  • Le colture possono essere ingegnerizzate per tolleranza aparticolari erbicidi attraverso l’inserimento di singoli nuovi geni


Le piante transgeniche

La tolleranza ad erbicidi

è il tratto dominante delle colture GM coltivate a livello commerciale

74% di colture GM coltivate nel 2000 erano tollaranti ad erbicidi (HT)

7% ‘stacked transgenes’ (HT + Bt gene per resistenza ad insetti)

% delle colture GM globali

coltura

tratto

soia*

HT

58%

colza

HT

6%

mais

HT

5%

cotone

HT

5%

cotone

HT+Bt

4%

mais

HT+Bt

3%

(* 36% della soia coltivata nel mondo è transgenica)


Le piante transgeniche

Colture tolleranti al Glyphosate

Le prime colture ingegnerizzate messe in commercio sono state quelle con tolleranza all’erbicida glyphosate (Roundup)

Attualmente molte colture presentano inserito questo tratto transgenico (soiia, mais, colza, cotone ecc)

Colza tollerante


Le piante transgeniche

Ingegnerizzazione per tolleranza a Glyphosate

Il Glyphosate inibisce un enzima cloroplastico essenziale nella biosintesi degli aminoacidi :

5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimic acid synthase (EPSPS)

Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione tradizionale

Un mutante del gene EPSPS è stato isolato da Agrobacterium, che introdotto in pianta conferisce tolleranza al glyphosate


Le piante transgeniche

tp

polyA+

EPSPS Transgene introdotto in pianta

Transit peptide from plant gene added to allow chloroplast import

Codon usage modified

for efficient expression

in plants

promoter

Agro. EPSPS

Regulatory sequences recognised by plant (either from plant gene or plant virus gene). In this case 35S CaMV promoter


Le piante transgeniche

H

HOOC

CH2

CH2

C

COOH

NH2

O

H

CH3

P

CH2

CH2

C

COOH

OH

NH2

Ingegnerizzazione tolleranza a Phosphinothricina

L-phosphinotricina è un ingrediente attivo negli erbicidi glufosinate / bialaphos

Questi erbicidi agiscono inibendo la glutamine synthetase (GS)

- GS necessaria per la sintesi di glutamine da glutamate e ammonio

- GS previene l’accumulo di ammonio a livelli tossici nelle cellule vegetali

glutamate

L-phosphinotricina


Le piante transgeniche

Piante tolleranti a Phosphinothricina

Non è stato possibile generare piante tolleranti al glyphosate attraverso mutagenesi e seliezione tradizionale

- trasformare piante con un mutante GS insensibile alla phosphinotricina

- trasformare il gene delle piante per un enzima che inattiva la phosphinotricina

I geni batterici (pat o bar ) che codificano per phosphinothricin acetyl transferase sono stati trasferiti in pianta

detossificano L-phosphinotricina attraverso acetilazione, così GS non è inibita

Coltivazioni commerciali di Cicoria, rape e mais tolleranti a Phosphinothricina


Le piante transgeniche

Tolleranza a Phosphinotricina Introdotta in pianta

Codon usage modified for efficient expression in plants

polyA

promoter

Bacterial pat

Regulatory sequences recognised by plant

(either from plant gene or plant virus gene).

Frequently use 35S CaMV promoter


Le piante transgeniche

Tolleranza a stress ambientali

Il progresso per gli stress ambientali attraverso il breeding classico è andato molto lentamente

Crop

Maize

Wheat

Soyabean

Sorghum

Oat

Abiotic losses (% record yield)

66%

82%

69%

81%

75%

La tolleranza di solito coinvolge molti geni e processi fisiologici

L’approccio transgenico ha dovuto sffrontare anche questi problemi ma alcuni progressi sonos stati fatti anche se ancora non ci sono piante in commercio


Le piante transgeniche

Risposta della pianta allo stress

Ozono

Riconoscimento

stress

Temperature

estreme

Stress transduction

asfissia

Alterazione

Espressione

genica

siccità

Alterazione

metabolismo

salinità

Risposte fisiologiche/ sviluppo


Le piante transgeniche

Fattori di transcrizione

Risposta della pianta allo stress

Riconoscimento

stress

?

?

Ca2+

Hormones

Stress transduction

Alterazione

Espressione

genica

Caratteri multigenici

Alterazione metabolismo

Es.

  • Antiossidanti prodotti in risposta a molti stress per detossificare dai radicali liberi (reactive oxygen species -ROS)

  • Soluti compatibili (osmo-protectants) sostanze osmoprotettive prodotte da alcune piante in risposta a stress osmotici come siccità e salinità

  • heat-shock proteins (HSPs) accumulate in seguito a stress da calore


Le piante transgeniche

Resistenza a siccità/salinità

Trehalosio è un osmoprotettivo contro stress ambientali: congelamento, salinità, caldo e essiccazione.

Il Trehalose (1--D-glucopyranosyl-glucopyranoside) è sintetizzato in due steps nei lieviti.

Zygosaccharomyces rouxii è uno dei lieviti più osmo-tolleranti, specialmente al sale.

Kwon, S.J., Hwang, E.W. & Kwon, H.B. (2004). Genetic engineering of drought resistant potato plants by co-introduction of genes encoding trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphate phosphatase of Zygosaccharomyces rouxii. Korean J. Genet.26, 199-206.

Patate transgeniche mofologicamente uguali ai parentali

NS ter

NS prom

trehalose-6-P synthase

trehalose-6-P phosphotase

nptII

CaMV

35S

LB

2A

RB


Le piante transgeniche

Piante transgeniche per resistenza a malattie


Le piante transgeniche

Impatto delle malattie sulle colture

La colture sono spesso coltivate in modo estensivo e in monocoltura.

Incremento del rischio di malattie epidemiche

Le malattie limitano in modo significativo la produttività e richiedono sostanziali apporti di prodotti chimici.

Crop

Maize

Wheat

Soyabean

Sorghum

Oat

Biotic losses* (% average yield)

42%

39%

41%

37%

54%

* Biotic losses include diseases, insects and weeds


Le piante transgeniche

Breeding tradizionale

  • insetti e funghi sono molto più distruttivi di virus e batteri

  • In alcuni casi, con il breeding tradizionale si è potuto introdurre geni di resistenza da specie selvatiche a specie coltivate.

  • Per alcune malattie non sono stati trovati geni di resistenza efficaci e durevoli

  • Riduzione della suscettibilità ai geni di resistenza

continua necessità di ricerca fonti di gene di resistenza


Le piante transgeniche

Vantaggi delle Transgeniche

Nessuna restrizione legata ad incompatibilità sessuale

Introduzione di resistenze in specie che in natura non presentano fonti di resistenze

Colture GM per resistenza ad insetti e virus sono commercializzate in USA Transgenic insect and viral resistant crops are already grown commercially in US e altri Paesi:

- mais, cotone, patata, pomodoro resistente ad insetti

- patata, papaya, zucchini resistenti a virus


Le piante transgeniche

Resistenza ad insetti

La resistenza ad insetti è il secondo più importatnte tratto tansgenico nelle colture commerciali GM

19% delle colture GM per resistenza ad insetti contengono il gene Bt

Un’altro 7% sono Bt + tolleranza ad erbicidi

% of global

Crop

Trait

GM crops

Bt

15%

Maize

Bt + HT

4%

Cotton

Bt

3%

Cotton

Bt + HT

3%

Maize


Le piante transgeniche

Tossine Bt

Le tossine prodotte da Bacillus thuringiensis uccidono solo gli insetti

Diversi ceppi di Bacillus thuringiensis producono diverse tossine, ciascuna attuiva solo per uo o poche specie d’insetti.

Le spore batteriche o isolati della tossina sono già disponibili come insetticidi organici


Le piante transgeniche

Tossine Bt

Tossine prodotte nelle spore, e formano cristalli proteici

Le tossine codificate da geni Cry

  • Attività della tossina;

  • protossina è digerita nell’intestino da proteasi + pH alcalino

  • protossina si lega ad un sito specifico sulla parete intestinale

  • avvengono ulcerazioni e diminuisce l’appetito

  • si ha la rottura della parete intestinale, larve muoiono


Le piante transgeniche

Colture Bt

Alcune colture (cotone, mais, patata ecc.) sono state trasformate con diverso geni Cry che producono tossine attive contro alcuni erbivori. Ad oggi sono stati utilizzati più di 40 diversi geni Cry

Codon usage modificato per un’efficiente espressione in pianta

polyA

Bt Cry

promotore

Sequenze regolatrici riconosciute dalla pianta


Le piante transgeniche

Colture Bt

  • Regole di conduzione per minimizzare l’insorgenze di resistenza a Bt

  • 20% mais non-BT (50% cotone non-Bt) in campo;

  • Monitoraggio

Introduzione di resistenze multiple

incremento dei livelli d’espressione

impatto con insetti non-target: ‘buffer zone’ di mais non Bt intorno a mais BT

‘Transgenic pollen harms monarch larvae". J.E. Losey et al., Nature 20 May 1999 (correspondence).È stato molto criticato per dati riferiti ad un solo anno, per uso di larve molto suscettibili.I lavori attuali riportano pochi se non effetti nulli, giusta comparazione con campi trattati con insetticidi


Le piante transgeniche

Resistenza a Virus

“RNA-mediated interference”:si basa sull’espressione di geni patogeno-derivati o da frammenti di geni (es. Resistenza patogeno derivata)

Interferisce con I normali processi patogenici del microbo sia a livello proteico (resistenza virale e batterica) sia a livello di RNA ( solo resistenza virale).

“Protein-mediated interference”:

- espressione di una tossina derivata batterica, inattivando l’enzima per controllare specifici Pseudomonas

- espressione costitutiva di “coat protein” virali (CPs) o proteine di movimento (MPs) per la protezione di piante a virosi.

Non si conosce bene il meccanismo d’interferenza mediata dalle proteine.

- necessari livelli di espressione elevati di “coat protein”


Le piante transgeniche

Papaya ringspot virus (PRV)

Questo virus ha avuto un enorme impatto in Hawaii , con forti riduzioni nella produzione di frutti freschi

Non esistono in natura geni di resistenza a questo virus, e senza la produzione di papaya transgenica la produzione industriale nelle Hawaii potrebbe essere distrutta.

Dal 1996 nelle hawaii si coltiva papaya PRV resistente.


Le piante transgeniche

Resistenza a PRV in Papaya

Il gene della coat protein di viene espresso mediante il promotore 35S CaMV.

La papaya è stata trasformata attraverso metodo biolistico.

promoter

polyA+

PRV coat protein gene

Regulatory sequences recognised by plant

(either from plant gene or plant virus gene).

In this case 35S CaMV promoter and terminator

Questo gene conferisce resistenza parziale a PRV in una varietà (‘Rainbow’) e resistenza completa in un’altra (‘SunUp’)

Gli agricoltori gestiscono la coltivazione con molta cura per minimizzare la pressione di selezione sui virus per il mantenimento della resistenza.


Le piante transgeniche

Would it surprise you to know

that saving a crop from a virus

helped save a community from

disaster? Through advancements

in plant biotechnology, researchers

developed a type of papaya that

is resistant to a virus that was

destroying Hawaii’s crops. This

healthier plant not only kept

Hawaiian farming communities

in business, it also resulted in an

increase in papaya production.

And its just one example of how

crops enhanced by plant bio-

technology could one day help

feed an ever-increasing world

population. The research is on-

going and the facts are there to be

examined. If you want to learn more

we invite you to call us or visit our

web site: www.whybiotech.com

Council for Biotechnology Information


Le piante transgeniche

Resistenza multipla a virus in zucchini

Geni “Coat protein” per 3 virosi (cucumber mosaic virus CMV; zucchini yellow mosaic virus ZYMV; watermelon mosaic virus 2 WMV 2) sono stati introdotti in Cucurbita pepo

- tutti espressi dal promotore 35S CaMV

CMV CP

ZYMV CP

WMV 2 CP

LB

RB

t

t

t

nptII

Prom

Prom

Prom

Prom = promoter t = terminator

protegge contro I 3 virus


Le piante transgeniche

Resistenza a virus in pianta

Transcapsidazione

  • Se la pianta viene infettata da un’altro virus questo potrebbe essere incorporato nel capside codificato dal transgene provocando un mascheramento virale.

  • La coat protein introdotta sarà sufficiente a produre il mascheramento?

  • Se ciò si verifica si possono avere nuove proprietà biologiche?

Sinergia

Se la pianta viene infettatabda un’altro virus, si possono avere manifestazioni di sintomi più gravi a causa della presenza della coat protein?

Ricombinazione

La frequenza del fenomeno potrebbe ssere incrementata? Si possono avere nuovi ricombinanti?


Le piante transgeniche

Quale futuro?


Le piante transgeniche

Miglioramento del valore nutrizionale degli alimenti


Le piante transgeniche

Modificazioni nutrizionali

Miglioramento del contenuto proteico e qualitativo

Incremento delle vitamine, antiossidanti, ferro e altri minerali ecc.

Rimozione dei fattori antinutrizionali quali inibitori delle proteasi e lecitine. Remove anti-nutritional factors e.g. protease inhibitors, lectins

Modificazione del contenuto in grassi saturi.

Incremento/decremento di fenoli e fibre


Le piante transgeniche

Miglioramento qualitativo delle proteine

Animali and uomini devono incorporare 10 aminoacidi essenziali attraverso il regime alimentare in quanto incapaci di produrli da se.

Il valore nutrizionale delle proeine di riserva delle sementi risulta spesso limitato.

posssono deficitare di uno o più aminoacidi essenziali per la salute umana (es. Nei legumi perdita di cisteina e metionina)

Il bilanciamento aminoacidico nelle sementi è stato manipolato in laboratorio mediante diverse strategie:

- introduzione di proteine di riserva nei semi da altre specie

- alterazione in vitro delle sequenze dei geni delle proteine di riserva

- manipolazione della pathway della biosintesi degli amino acidi per incrementarne alcuni

Strategie simili sono state utilizzate per migliorare il contenuto e la composizione proteica in colture no-food


Le piante transgeniche

‘Increased nutritive value of transgenic potato by expressing a nonallergenic seed albumin gene from Amaranthus hypochondriacus’

Chakraborty et al., PNAS 97, 3724-3729 (2000)

La patata, la quarta coltura nel mondo, è utilizzata per produrre alimenti, mangimi, amido e alcool.

Limitata in lisina, tirosina, metionina e cisteina

Patate trasformate con gene di Amaranthus hypochondriacus che codifica per la produzione di albumina nei semi presentano un buon bilanciamento aminoacidico

p35S CaMV

2 costrutti alternativi. Promotore constitutivo o tubero-specifico

pSB8

AmA1

Nos 3’

AmA1

Nos 3’

pSB8G

pGBSS

l’espressionei nei tuberi è da 5 a 10 volte maggiore quando si utilizza il promotore GBSS promoter piuttosto chi il 35S


Le piante transgeniche

Cambiamenti qualitativi proteici nelle patate transgeniche

contenuto in aminoacidi essenziali da 3 a 5 volte più elevato

Contenuto proteico totale incrementato del 35-45%

8-

Fold

increase

4-

1-

D E S G H R T A P Y V M C I L F K

Amino acid

Le piante producono il doppio rispetto al wild-type

L’albunia di Amaranthus non è allergenica :

- già utilizzata come farina in Messico e Sud America

- test iperallergenici condotti su animali come mangime non evidenziano reazioni allergiche


Le piante transgeniche

Vitamina A

La vitamina A (retinolo) è essenziale alla crescita umana.

Il nostro corpo non produce vitamina A, e la possiamo incamerare dalla dieta per due vie:

- 50% come pro-Vitamina A dei carotenoidi delle piante che viene convertita il vitamina A nell’intestino.

- ingestione diretta da alimenti animnali e supplementi.

Tutti I carotenoidi che contendono anelli  possono essere convertiti in retinolo, e una delle più importanti pro-vitamine dei carotenoidi è il -carotene


Le piante transgeniche

Deficenza in vitamina A

400 milioni di persone sono a rischio per deficienza in vitamin A (VAD), in particolare in Asia e Africa.

circa 2.5 milioni delle morti annue riguardano bambini sotto i 5 anni

VAD rende I bambini particolarmente suscettibili ad infezioni.

0.5 milioni di bambini diventano cieci a causa della VAD

Il ricorso a supplementi in vitamina A è riuscito a ridurre I problemi del 50% nelle aree soggette, ma ciò risulta molto oneroso e non utilizzabile in tutte le aree.


Le piante transgeniche

Pro-vitamina A in pianta

-carotene è un pigmento richiesto nella fotosintesi

- prodotto in tutti I tessuti verdi della pianta

- prodotto anche nell’endosperma del mais giallo e del sorgo

Il riso è una coltura fondamentale per la gran parte del modo ma la granella di riso non produce vitamina A o il suo precursore, -carotene

La VAD è un problema molto serio nelle regioni in cui il riso è la derrata alimentare principale; più del 70% di bambini sotto I 5 anni ne sono affetti

La ricerca di mutanti di riso con -carotene neklla granella è stata un insuccesso.

- alcune varietà di riso non lucido “unpolished rice’ (riso bruno e riso rosso) possono produre vitamina A ma la gran parte di riso è lucido con l’aleurone rimosso prima che diventi rancido all’immagazzinamento.


Le piante transgeniche

Produzione del ‘Golden Rice’

Il progetto riguardante l’introduzione della pro-vitamina A è durato 8 anni

Ingo Potrykus and Peter Beyer con fondi dell Rockefeller Foundation e EU

inizialmente è stato mostrato che l’ultimo precursore della pathway dei carotenoidi nell’endopserma del riso è il geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)

Può arrichire in -carotene via 4 enzimi:

phytoene synthase, phytoene desaturase, -carotene desaturase, lycopene cyclase

Questi geni sono stati isolati da narciso ed introdotti in riso ad uno ad uno.


Le piante transgeniche

Produzione del ‘Golden Rice’

Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP)

Phytoene

 -carotene

Lycopene

ß-carotene


Le piante transgeniche

Produzione del ‘Golden Rice’

Geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP)

1° esper.mostrava che riso transgenico espirmente PS di narciso era normale, fertile and produceva phytoene

Phytoene

synthase

Phytoene

Phytoene

desaturase

Erwinia uredovora double desaturase

crtI

 -carotene

 -carotoene

desaturase

  • Si può deviare la pathway verso il b-carotene

  • (2) Incanalare la GGPP via da altre pathways nion ha effetti dannosi

Lycopene

lycopene

ß-cyclase

ß-carotene

Daffodil

Erwinia


Le piante transgeniche

‘Engineering provitamin A (ß -carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm’.

Ye et al., Science 287,303-305 (2000).

LB

RB

Erwinia

Daffodil 1

ter

pro

ter

pro

tp

LB

RB

pro

Hyg resis

ter

pro

Daffodil 2

ter

Due T-DNAs codificanti per 3 geni della pro-vitamin A (più il gene marcatore selettivo) sono stati introdotti insieme via Agrobacterium attraverso co-transformation

Daffodil 1 = phytoene synthase

Daffodil 2 = lycopene ß-cyclase

Erwinia = Erwinia double desaturase - with added transit peptide, expressed from 35SCaMV promoter

With own native transit peptides and endosperm-specific promoter from rice glutelin (GT1 promoter)

La granella del riso transgenico mostrava un colore giallo oro brillante. La migliore linea aveva l’85% di carotenoidi come ß-carotene


Le piante transgeniche

Produzione del ‘Golden Rice’


Le piante transgeniche

Produzione del ‘Golden Rice’

Paine, J.A., Shipton, C.A., Chaggar, S., Howells, R.M., Kennedy, M.J., Vernon, G., Wright, S.Y., Hinchliffe, E., Adams, J.L., Silverstone, A.L. & Drake, R. (2005).Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A contentNature Biotechnology 23:482-487.

In molte pathways biosintetiche multi steps esistone degli steps limitanti.

Il collo di bottiglia in questo caso era rappresentato dalla attività enzimatica di PSY (gene codificante per la phytoene synthase).

Dopo aver provato diversi gei PSY provenienti da diverse fonti è stato provato che la combinazione gne del mais e del riso davano la migliore combinazione


Le piante transgeniche

Produzione del ‘Golden Rice’

Golden Rice2 che è stato ottenuto accumulava 37 µg/g di carotenoidi di cui 31 µg/g ß-carotene circa 23 volte quello del Golden Rice precedente.


Le piante transgeniche

Alimenti funzionali

Altre definizioni:

  • Alimenti supplementati con ingredienti che conferiscono benefici alla salute.

  • Alimenti che producono effeti benefici al corpo mediante adeguata nutrizione.

Esisteno diversi lavori in corso che utilizzano Gm per generare alimenti funzionali quali ad esempio incremento degli antiossidanti, delle vitamine, dei fenoli e delle fibre.

Per esempio:

La supplementazione della dieta con carotenoidi,lycopene e ß-carotene, reduce le malattie al cuore, alcuni tumori ecc.

I pomodori sono la principale fonte di lycopene nella dieta e hanno anche un buon contenuto in ß-carotene

Lo stesso gene phytoene desaturase (crtI) di Erwinia che è stato utilizzato nel ‘golden rice’ è stato introdotto in pomodoro per aumentare il ß-carotene


Le piante transgeniche

Neutraceuticals

Ralley, L., Enfissi, E.M.A., Misawa, N., Schuch, W., Bramley, P.M. & Fraser, P.D. (2004). Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants. Plant J. 39 477-486

Astaxanthin, canthaxanthin, and zeaxanthin sono carotenoidi ad alto valore utilizzati nellì’industria come coloranti o supplementi alimentari.

Hanno anche un elevato potere antiossidante ed è stato riportato che portano benefici alla salute attraverso un’azione immunologica e prevevendo la formazione dei tumori.

Sono state generate piante transgeniche esprimenti I geni del carotenoide 4,4’ oxygenase (crtW) e 3,3’ hydroxylase (crtZ) di Paracoccus, simultanemente


Le piante transgeniche

Vaccini


Le piante transgeniche

Cosa sono i vaccini edibili?

Un vaccine edibile è una proteina geneticamente ingegnerizzata da un materiale edibile che, una volta alterata geneticamente, viene inserita nel materiale, Ingerita oralmente porta una produzione naturale di anticorpi contro una specifica proteina virale, proprio come gli altri vaccini

I vaccini edibili differiscono da quelli tradizionali nel modo in cui essi stimolano la produzione di anticorpi nel ricevente che, nel caso dei vaccini edibili avviene durante la digestione


Le piante transgeniche

Vaccini

“La proteina antigene dovrebbe interagire con la mucosa del tratto gastrointestinale , attivando le cosidette “mucous type of immune protection”. Come risultato l’organismo dovrebbe sintetizzare gli anticorpi contro la proteina virale. Quindi la proteina antigene è l’iniziatore che stimola il corpo a produrre anticorpi necerrari ad una efficace vaccinazione.


Le piante transgeniche

Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory syncytial virus-F protein induces a systemic immune response

Jagdeep S. Sandhu1, Sergei F. Krasnyanski2, Leslie L. Domier3, Schuyler S. Korban2, Mark D.Osadjan1; & Dennis E. Buetow1

Transgenic Research 9: 127–135, 2000.

Respiratory syncytial virus (RSV)

fruit-based edible subunit vaccine against RSV was developed by expressing the RSV fusion (F) protein gene in transgenic tomato plants.

preferentially fruit-expressed E8 promoter


Le piante transgeniche

Biotech Farm


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