ATP 生物荧光肿瘤体外药敏检测技术 ( ATP-TCA) 的建立及其 临床应用研究

1. ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)的建立及其临床应用研究ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术(ATP-TCA)的建立及其临床应用研究 硕士研究生：傅军 导师：张伟 研究员

2. 答辩提纲 • 第一部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术概述 • 第二部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术及质量 • 标准的建立 • 第三部分：ATP-TCA技术的临床应用研究

3. 第一部分 ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测 技术概述

4. 研究背景 • 化学治疗是肿瘤的三大治疗手段之一。近30年来，虽然某些恶性肿瘤的化学治疗有明显改善，但多数肿瘤，特别是实体瘤疗效仍不理想。这与肿瘤存在个体差异性，以及多重耐药性等因素有关。 • 因此如何选择有效药物，进行有的放矢的治疗早已成为化疗界所关注的问题。

5. 1. 主要的药敏检测方法及其存在的问题 药敏检测方法 存在问题 标本可评价率低，仅有40~70％。 实验周期长，需要2周以上 测试药物种类和数量有限 操作繁琐，难以标准化 阳性预测值较低，仅有40～60％ 集落形成法（HTCA） 四唑蓝比色法 (MTT) 敏感性较差，最低仅能检测500个细胞   量程较小，有效量程在2.0以内 可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤 人为判断因素较大，难以推广 标本可评价率不高，仅有70～80％ 阳性预测值较低，仅有70～80％ 细胞毒性差异染色法 (DiSC) 实验人员接触放射，不利于健康 标本可评价率不高，仅有70～80％   测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞 对某些药物的测试结果存在假阴性 胸腺嘧啶核苷掺入法 (3H-TdR)

6. 理想的药敏检测方法应该 • 具备的条件 • 操作简便，可以标准化，便于推广 • 标本可评价率高 • 检测敏感、可靠、客观 • 4. 具备产业化条件

7. 2. ATP生物荧光药敏检测技术的优点: 敏感性好 可检测最少10个细胞。而其他技术则一般需要500个细胞以上 可评价率高 标本可评价率在90%以上 快速检测 完成ATP检测仅需30分钟，而其它方法需1～4小时的孵育时间 量程宽 检测线性范围为10～100000个细胞/孔（96孔培养板） 精密度好 变异系数（CV）小于10%，在国家标准（10%）的范围内 结果准确 整体预测值为86% 检测效率高 同时动态检测评估化疗药物6个剂量下对肿瘤的杀伤作用 高通量检测 适合96、384、1536孔板检测分析 自动化程度高 实验数据计算机软件自动分析，分析结果直观可靠 稳定性好 具备产业化条件

8. 3. ATP-TCA技术原理： Luciferase ATP + Luciferin + O2 AMP + 2Pi + Photons +Oxylaluciferin 在有氧条件下, 荧光酶（luciferase）可以催化荧光素（luciferin）释放出荧光（波长为562nm），同时ATP转变成AMP。所释放的荧光强度与胞内ATP含量呈正相关。细胞死亡后，胞内ATP迅速水解，而活细胞的ATP含量基本恒定。因此所测得的荧光强度反映了活细胞的数量。比较药物系列浓度对培养细胞的不同抑制率，参照相应判断指标，从而可以评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果。

9. 荧光强度与活细胞数量的关系

10. 4.技术流程 Tumor Mechanical and enzymatical dissociation Addition of drugs/medium Single Cell suspension Incubation for 5-7 days ATP extraction and stabilization ATP- Luminescence Construction of dose-response plots Software Evaluation

11. 5.适用肿瘤类型 神经母细胞瘤 黑色素瘤 甲状腺癌 结直肠癌 乳腺癌 卵巢癌 胰腺癌 肉瘤 胃癌 肺癌 6.适用肿瘤标本类型 • 实体瘤标本 • 胸腹水 • 活检淋巴结标本

12. 7. 国内外研究历史回顾 1. 1982年，Moyer等首先提出内源性ATP的含量可以反映细胞活性;随后Kangas等相继证实生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性的检测方法。 2. 自1988年，Sevin首先将此方法用于新鲜肿瘤组织的药敏检测，在欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。 3. 1998年，Kurbacher等人报道了ATP-TCA辅助化疗与传统化疗比较的临床Ⅱ期试验结果，试验结果表明，ATP-TCA指导的化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式更能提高临床疗效，延长病人总生存期和无进展生存期。 4. NIH的GOG (Gynecologic Oncology Group)项目组认为ATP-TCA是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目(1998)。 5. 至今该技术的临床应用相关文献已有200余篇。 6. 国内尚无该技术产业化的报道。

13. 时间 国家 研究人 肿瘤类型 结论 1988年 美国 Sevin BU, Peng ZL 卵巢癌 阳性预测值：92%，阴性预测值：90% 整体预测精确值：86% 1990年 日本 Jinushi K, Hirabayashi 胃癌 预测精确性为88.9% 1993年 瑞士 Koechli OR, Avner BP 乳腺癌 阳性预测值：90%，阴性预测值：86% 整体预测精确值：85% 1995年 美、英、德三国协作 Andreotti PE Cree IA 顺铂耐受卵巢癌 整体预测精确值：92% 1996年 英国 Cree IA, Kurbacher CM III/ IV期乳腺癌 整体预测精确值：76％ 1997年 日本 Kawamura H, Ikeda K 胃肠道肿瘤 阳性预测值：64%，阴性预测值：100% 整体预测精确值：84% 2000年 美国 Konecny G, Crohns C FIGO Ⅲ期卵巢癌 阳性预测值：66%，阴性预测值：89% 敏感性：95%，特异性：44% 2000年 德国 Mollgard L, Tidefelt U 急性非淋巴细胞白血病 阳性预测值：86%，阴性预测值：100% 2001年 美国 O'Meara AT, Sevin BU 上皮性卵巢癌 阳性预测值：83%，阴性预测值：56.5% ATP-TCA技术的临床相关性研究结果

14. ATP-TCA与其它药敏检测方法的相关性 ATP-TCA技术与DiSC法的相关性 ATP-TCA技术与MTT法的相关性

15. 8.目前先进国家对该技术的评价 • 1998年德国DCS公司将该技术产业化，并获得国际ISO质量评估体系认证，在欧洲和北美市场获得准入。 • 2.2001年，美国全国医疗保险协会(Health Maintenance Organization)认为，该技术是一项精确和可靠的并能指导医生选择用药的先进技术，建议在全美进行医疗保险赔付。目前在加州等6个州已获医疗保险赔付。 • 3. 2003年日本厚生省和保险联合会也认为，该技术是一项先进的临床医学项目，该技术指导的肿瘤化疗较传统的化疗方案更能明显提高胃肠道肿瘤的治愈率，建议该项技术在全国范围内获得医疗保险赔付。 因此，ATP-TCA技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感，可靠，具有极大的临床应用价值

16. 第二部分 ATP-TCA药敏检测技术及质量标准的建立

17. ATP-TCA技术的核心试剂 • 1. 荧光酶试剂 • 热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可 • 靠性，满足临床实际工作的需要 • 2. 培养基 • 肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞 死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性 下面我将就这两个核心试剂的研发汇报我所做的一些工作

18. 工作内容及进展 ● 荧光酶基因克隆、点突变、表达及纯化(2001,4－2001,10) ● 肿瘤细胞选择性培养基配方筛选及优化(2001,5－2001,12) ● 检测技术核心试剂的质量标准的建立(2002,1－2002,3)

19. 重组荧光酶研发路线 设计点突变引物，定点突变荧光酶第245和215位氨基酸序列 自荧火虫体内发光腺体提取荧光酶mRNA 逆转录为cDNA,PCR扩增，克隆构建重组质粒PET22b-luc 通过蛋白工作站，纯化生产重组荧光酶 筛选高表达株，高效稳定表达重组荧光酶 将含点突变PET22b-luc导入原核高效表达系统Ecoli-BL21 制备冻干 荧光酶制剂

20. 荧光酶基因的克隆和鉴定 PCR产物电泳图 重组质粒PET22b-luc鉴定图

21. 野生型荧光酶基因编码序列(1653bp) atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgc*ctgcgtcagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcac*ggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattcaaagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctgggggcgcacctctttcgaaagaagtcggggaagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtctttaattaaatacaaaggatatcaggtggcccccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagtccaaattgtaa M215：GC →AGAla→LeuM245：C →G His→Gln

22. 荧光酶基因突变位点测序图 GC →AG,导致第215位氨基酸置换(Ala→Leu) G →C ,导致第245位氨基酸置换(His→Gln) 测序单位：上海生工

23. 荧光酶蛋白质电泳图 荧光酶表达电泳图 纯化后电泳图

24. 野生型和突变型荧光酶活性比较 图1：野生型和突变型荧光酶热稳定性比较 图2：野生型和突变型荧光酶发光效率及线性关系比较

25. 重组荧光酶制剂稳定性研究 放置 温度 活性半衰期 液体保存 冻干品 -20℃ 80天 360天 4℃ 20小时 180天 25℃ 3.8小时 21天 37℃ 0.8小时 3天 因此，我们将热稳定性和发光效率均好的M245突变荧光酶冻干制剂作为药敏检测用酶制剂 *重组荧光酶为M245突变型荧光酶

26. 肿瘤细胞选择性培养基研究

27. 选择性培养基生长支持度及选择性研究 肿瘤细胞系生长曲线 正常、良性卵巢及肿瘤组织培养生长曲线

28. 新鲜瘤组织体外培养效果图

29. Continued

30. 卵巢癌原代培养前后HE及免疫组化染色 PAN-KERATIN染色

31. 正常卵巢上皮细胞及成纤维细胞 培养结果 成纤维细胞培养抑制效果图 正常上皮细胞培养抑制效果图

32. 培养前后细胞组成变化 培养前细胞组成 6天培养后细胞组成 淋巴 上皮 成纤维 肿瘤 淋巴 上皮 成纤维 肿瘤 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 40-50% 10-25% 5-10% 10-20% <1% <10% <10% >75% 选择性培养基的研究结果表明该培养基具有良好的选择性，适合肿瘤体外药敏检测的需要

33. 质量标准 1、培养基对肿瘤细胞生长支持程度 以MCF-7细胞系作为标准细胞系，按2000个细胞/孔接种浓度接种至96孔培养板中，培养七天后，要求测定的RLU值>400000。 2、ATP标准曲线 将ATP标准品配成250ng/ml，倍比(3×)稀释7次，做出ATP浓度与RLU（扣除本底吸收值）的标准曲线，要求：r>0.995，最小ATP浓度（0.11ng/ml）的RLU>400。 3、精密度 选MCF-7细胞系低、中、高（500、10000、40000个）数目的细胞，分别测定十组RLU值，要求： CV<10% 4、敏感度 50个MCF-7细胞>440RLU，同时本底值<200 RLU。

34. 第三部分 ATP-TCA体外药敏检测技术的临床应用研究

35. ATP-TCA药物测试方式

36. 评价标准 强敏感(SS)：IC50<25%及IC90<100%PPC 中度敏感(IS)：IC50<25%及IC90>100%PPC 轻度敏感(MS)：IC50>25%及IC90<100%PPC 耐药(R)：IC50>25%及IC90>100%PPC IC90:抑制90%肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度百分比 IC50:抑制半数肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度百分比 PPC:一定临床用药剂量对应的血浆峰值浓度

37. 临床相关性研究病人资料

38. 临床相关性研究初步结果 表1：卵巢癌体外药敏检测与临床疗效的比较 例数 体外检测 体外检测 敏感 (SS+IS) 耐药(WS+R) 共计 体内敏感（CR+PR） 18 2 20 体内耐药（SD+PD） 1 11 12 共计 19 13 32 *34例卵巢癌中可评价标本为32例，标本可评价率为94.1%

39. 表2：卵巢癌体外药敏检测真实性评价 整体预 测值 阳性预 测值 阴性预 测值 灵敏度 特异性 90.6% 94.7% 84.6% 90% 91.7%

40. ATP-TCA药敏检测的临床应用 1. 设计个体化治疗方案 2. 研究新的联合化疗方案 3. 化疗药物新适应症研究

41. 一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果 1. 设计个体化治疗方案

42. 药物名称 IC50（PPC%） 杀伤作用评估 BLM+DDP+VCR 12.69% 部分敏感药物 BLM+DDP+5-FU 18.59% 轻度敏感药物 BLM+CBP +VP16 14.79% 部分敏感药物 VP16+CBP 28.16% 轻度敏感药物 THP+DDP+5-FU 14.79% 部分敏感药物 VP16+DDP+VCR 6.32% 较敏感药物 IFO+VP16+ADM 25.5% 轻度敏感药物 CTX+ADM +CBP 32.4% 耐药药物 NVB+EPI 0.76% 强敏感药物 检测结果分析

43. 治疗效果 治疗前 该患者经多重化疗方案复发，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结广泛转移，气管、食管压迫移位并伴有吞咽困难。胸水活检发现癌细胞，淋巴结病理活检证实为绒毛膜上皮癌，HCG激素水平为600u/ml。 治疗后（NVB+EPI方案一个半周期以后） 胸水消失，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结病灶缓解或消失，可以进食，HCG激素水平降至60u/ml。 因此ATP-TCA技术对于开展肿瘤患者的个体化治疗极具指导意义

44. 2. 卵巢癌新的联合用药方案研究 2.健择与表阿霉素的联合方案 1.健择与顺铂的联合方案 例数 肿瘤细胞对化疗药物的反应 强敏感SS 中度敏感MS 轻度敏感LS 耐药R 32 6 14 8 4 体外有效率＝ (SS+MS)/n = (6+14)/32= 62.5% 例数 肿瘤细胞对化疗药物的反应 强敏感SS 中度敏感MS 轻度敏感LS 耐药R 10 2 3 3 2 体外有效率＝ (SS+MS)/n = (2+3)/10= 50%

45. 3. 化疗药物新适应症研究 羟基喜树碱 (Hydrocamptocin) 原用途：消化道和泌尿系肿瘤 卵巢癌原代培养药敏测试结果 肿瘤细胞对化疗药物的反应 例数 强敏感SS 中度敏感MS 轻度敏感LS 耐药R 32 4 5 13 10 有效率＝ (SS+MS)/n = (4+5)/32 = 28.1%

46. 长春瑞宾(Vinorelbine, Navelbine) 原用途：非小细胞肺癌、转移性乳腺癌 卵巢癌原代培养药敏测试结果： 肿瘤细胞对化疗药物的反应 例数 强敏感SS 中度敏感MS 轻度敏感LS 耐药R 32 2 5 9 16 体外有效率＝ (SS+MS)/n = (2+5)/32 = 21.9% 因此ATP-TCA技术的建立为肿瘤新化疗方案的研究和临床应用建立了重要技术平台

47. 讨论 ATP-TCA检测技术是一种先进的药敏检测技术，其具有相关性好（r=0.9981）；量程宽，跨越4个数量级（10-80000个细胞）；检测敏感程度高（最小检测10个细胞）的优点。 34例卵巢癌体外药敏检测结果表明，ATP-TCA技术可反映不同病人对药物的敏感性的个体差别，标本可评价率高，其结果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性：整体预测值90.6%，阳性预测值94.7%，阴性预测值84.6%，敏感性90%，特异性91.7%。 同时，该技术对抗肿瘤药物筛选和应用、临床药物新适应症研究、化疗方案筛选和评估以及推广个体化治疗具有实际指导意义。 本研究为该技术的初步临床应用研究，为了进一步证实其临床应用价值，大样本的病例药敏研究是必要的。

48. 研究总结 1. 通过基因工程技术克隆、点突变、表达和纯化出具有较高热稳 定性和发光效率的重组荧光酶制剂。 2. 筛选出适用于体外药敏检测的肿瘤细胞选择性培养基，填补了国内在该领域的空白。 3. 建立了ATP-TCA技术核心试剂的质量控制标准，为该技术的产业化奠定了基础。 4. 以卵巢癌为模型开展肿瘤体外药敏检测，初步研究表明ATP-TCA是一种较为可靠的药敏检测方法，其结果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性。 5. 该药敏检测方法对抗肿瘤药物筛选和应用、临床药物新适应症研究、化疗方案筛选和评估以及推广个体化治疗具有实际指导意义。

49. 发表论文 已发表 1.王燕，傅军等.脂肪酸合成酶在非小细胞肺癌诊断及预后的临床意义.中华外科 杂志.2001,14（5）45-47. 2.Xu M, Jin Y-L, Fu J, The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J Gastroenterol. 2002,8(2):200-2. 待发表 3.Jun Fu, Ping Qu, Mo Li, et al.Expression of plant associated human cancer antigen in normal, premalignant, and malignant esophageal tissues. World J Gastroenterol. 4.傅军，田海梅等.植物相关人肿瘤抗原在乳腺癌中的表达及其临床意义.中华肿瘤杂志。 5.田海梅，傅军等.人乳腺癌细胞异质性及其生物学行为研究.中华肿瘤杂志。

50. 致谢 衷心感谢我的导师张伟研究员三年来对我的辛勤教诲和培养。本文是在他的悉心关怀和指导下完成的。三年来导师在科学上的远见卓识、严谨的工作作风、虚怀若谷的胸怀和正直的人品一直是我学习的楷模并使我受益终身。 本论文是在肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心完成的，在这里得到了田海梅老师的极大支持和指导。实验室刘毅、曲平、刘朝阳老师都给予我热情的帮助、支持和指导，我的师弟黄泓，王小兵也参与了部分研究工作，在此表示最衷心的感谢。 本课题系由肿瘤医院妇瘤科与肿瘤生物学检测中心合作进行，肿瘤标本由妇瘤科提供，在这里得到了吴令英主任和张凯主治医师的热情指导和帮助，在此向他们表示衷心的感谢。 教育处林赛荣老师和王珑珑老师在我的学习和生活上给予许多关怀、帮助和照顾，令我感激不尽。 谨在此向所有关心和帮助过我的老师和同学致以衷心的感谢。