“O PAPEL DA VIA HEDGEHOG NAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS”

1. Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas Instituto de Ciências Biomédicas Universidade Federal do Rio de Janeiro Hospital Universitário Clementino Fraga Filho “O PAPEL DA VIA HEDGEHOG NAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS” Projeto de Tese de Mestrado Agnes Naomi Yoshimoto Orientador:   Heitor Siffert Pereira de Souza Prof. Adjunto de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da UFRJ

2. Doençainflamatória intestinal • Doençasinflamatóriasintestinais, de etiologiamultifatorialnãototalmenteconhecida, podendoteracometimento extra-intestinal, cursocrônico e variável, com períodos de atividade e de remissão

3. Doençainflamatória intestinal Doença de crohn Retocolite ulcerativa • > 90% • Grande impactonasociedade: • Bimodal : acometemaisjovens dos 20 aos 40 anos e > 60 anos (15%) • Incidência : RCU 10 a 20 /100000 e DC 5 a 10 /100000, vemaumentando • Etiologiadesconhecida • Resposta terapêutica imprevisível

4. Caracterizando RCU e DC

5. Manifestaçõesclínicas Retocolite Ulcerativa Doença de Crohn Diarréia Constipação Dor abdominal crônica Perda de peso Febre Doença perianal Manifestações extraintestinais Os sintomas variam de acordo com a localização da doença • Diarréia Hemorrágica • Cólica abdominal • Tenesmo • Perda de peso • Sintomas sistêmicos • Manifestações extraintestinais • Os sintomas dependem da extensão e gravidade da inflamação

6. Achadosendoscópicosda DII RCU DC Reprinted by permission of Blackwell Science, Inc. Lashner BA, Brzezinski A. In: Di Marino AJ, Benjamin SB (eds). Gastrointestinal Disease: An Endoscopic Approach. 1997:582-592.

7. Localização e extensão DII RCU DC 40% Colite Distal/ Lateral Esquerda 40% Ileocolite 30% Proctite 25% Colite 30% Ileíte/ Jejunoileíte 30% Extensa/ Pancolite 5% Gastroduodenite

8. Achadoshistopatológicos Coliten transmural do cólon Infiltrado mononuclear e microabscesso cripta

9. ETIOPATOGENIA DAS DII FATORES GENÉTICOS e AMBIENTAIS COMENSAIS ALIMENTOS PATÓGENO ESTIMULAÇÃO SISTEMA NÃO-LINFÓIDE SISTEMA IMUNITÁRIO MEDIADORES SOLÚVEIS MOLÉCULAS DE ADESÃO CITOCINAS FATORES DE CRESCIMENTO ANTICORPOS AUTOANTICORPOS INFLAMAÇÃO EICOSANÓIDES ENZIMAS PROTEOLÍTICAS MRO NO NEUROPEPTÍDIOS Adaptado de: Fiocchi C, Gastroenterology 1998; 115: 182

10. Genética • Etiologia poligênica • Identificados loci de suscetibilidade IBD1-IBD9 • Maioria requer confirmação e validação funcional • Polimorfismos do CARD15/NOD2 no locus IBD1 predispõem a DC (Hugot et al. 2001; Ogura et al., 2001) • Variantes do SLC22A4/A5 no locus IBD5 predispõem a DC (Petekova et al., 2004) • Variantes do DLG5 no locus IBD5 predispõem a DC (Stoll et al., 2004) • Variantes do ICAM-1 no locus IBD6 têm associação com DII (Neville et al., 2004) • Associação de variantes com DC têm influência sobre fenótipo, mas sofrem variação populacional

11. Microflora entérica Normal ou anormal ? Alterações quantitativas e qualitativas Redução de Bifidobacterium e Lactobacillus Aumento de bactérias anaeróbicas Perda da tolerância para bactérias normais? Reposta imunitária contra bactérias de baixa patogenicidade?

12. Etiologia Genética Ambiental/ Infecciosa Fatores imunitários e não imunitários

13. Anti-inflamatórios Pró-inflamatórios Inflamação intestinal crônica: desequilíbrio de mediadores imunológicos

14. Polarização da reposta imunitária nas DII Doença de Crohn Retocolite ulcerativa

15. APOPTOSE PROLIFERAÇÃO ALIMENTOS COMENSAIS PATÓGENOS Linf. T Linf. T DOENÇA DE CROHN INFLAMAÇÃO CONTROLADA INFLAMAÇÃO FISIOLÓGICA

17. Evolução da terapia das DII: resultado da compreensão dos mecanismos patogênicos

18. Via de sinalização Hedgehog

19. Via de sinalização – Hedgehog • pertencem a uma família de moléculas de sinalização intracelular originalmente identificadas na Drosophila, gene descoberto 1992 • Com 3 homólogos em vertebrados (Ihh, Dhh, Shh), dentre os quais Shh tem sido a mais bem estudada • Sintetizada como uma proteína precursora de 45 kDa, Shh sofre autoproteólise gerando um domínio C-terminal e outro N-terminal (atividade sinalizadora). O domínio Shh-C atua como colesterol-transferase, modificando a estrutura de Shh-N Physiol Rev • VOL 87 • OCTOBER 2007

20. Via de sinalização – Hedgehog Shh interage com um complexo receptor composto de duas proteínas trans-membrana, patched (ptc) e smoothened (smo). Ptc constitui a sub-unidade de ligação, enquanto que smo é responsável pela transdução do sinal que, por sua vez, é mediada pela família Gli de fatores de transcrição (Gli1, 2 e 3).

21. Via de sinalização – Hedgehog • A via de sinalização Shh é fundamental na regulação de processos de desenvolvimento embrionário de vários órgãos e tecidos (morfogênese do TGI), e sua reativação estaria associada ao aparecimento de tumores malignos (pâncreas). • A via tambématuanahomeostasia do cólonadulto. Evidênciassugeremseuenvolvimentonamaturação dos enterócitos. • Enterócitos de ratostratados com ciclopamina ( inibidor do Smo), apresentouaumento Bmp4 ( alvoepitelialWnt ) das bases dacriptaemdireçãoaotopo das criptas • Acredita-se que a via hegdeghogatuariarestringindo a atividadeWntna base dacripta

22. Via de sinalização – Hedgehog • Recentemente, foi demonstrado a presença da via Shh como componente fisiológico da resposta de linfócitos T periféricos e também em processos imunopatológicos • A análise do ciclo celular de linfócitos T CD4 isolados do sangue e estimulados com Shh, revelou que a adição exógena de Shh aumenta a proliferação celular de células ativadas via TCR e o bloqueio com anticorpo anti-Shh diminui a proliferação . • Os mecanismos pelos quais Shh contribui para a homeostase de células imunitárias e a neovascularização são pouco compreendidos. É possível que a via Shh esteja envolvida na patogênese das DII.

23. Projeto A via de sinalização Shh está envolvida na proliferação de células inflamatórias da mucosa intestinal e na angiogênese, constituintes fundamentais do processo inflamatório crônico das DII

24. Objetivos e metas 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa intestinal de pacientes com DII. 2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII. 2.1 analisar proliferação e apoptose de células mononucleares da lâmina própria isoladas da mucosa intestinal e tratadas com adição ou bloqueio de Shh; 2.2 analisar a expressão de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias, e de fatores angiogênicos, da mucosa intestinal tratada com adição ou bloqueio de Shh; 2.3 analisar as vias de sinalização que regulam a transdução de Shh. • 1.1 localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh na mucosa intestinal de pacientes com DII e em controles; • 1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em mononucleares isolados da lâmina própria intestinal;

25. Material e métodos • Pacientes • Espécimens cirúrgicos e biópsias endoscópicas de áreas inflamadas e não-inflamadas da mucosa intestinal de pacientes com DII e de controles • Adultos de qualquer origem etnica que tenham concordado e assinado o termo de consentimento já aprovado pelo CEP • O diagnóstico de DII será baseado em critérios clínicos, laboratoriais, radiológicos, endoscópicos, e histológicos usuais. • Variáveis relacionadas com o diagnóstico de DII (atividade clínica da doença, extensão do acometimento intestinal, tempo de doença, tipo de tratamento) serão registradas e consideradas na análise final de resultados . • Serão utilizados os índices de atividade de doença Harvery e Bradshaw para DC, e o de Truelove & Witts, para RCUI .

26. Material e métodos • Pacientes • Critérios de exclusão: risco teórico excessivo de sangramento, ou de intolerância a procedimentos endoscópicos prolongados e pacientes em uso de AntiTNF. • 20 ml de sangue periférico poderão ser coletados no momento do procedimento endoscópico ou cirúrgico após terem assinado termo de consentimento livre e informado. • O estudo apresentará um caráter confidencial durante todas as etapas do projeto, sendo os dados pessoais conhecidos apenas pelo investigador principal.

27. Material e métodos • 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa intestinal de pacientes com DII • 1.1 localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh na mucosa intestinal. •  técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh N-19, anti-ptc C-20 e anti Gli1)  A análise das lâminas será feita ao microscópio óptico, com o auxílio de um programa computadorizado para captura e análise de imagens •  estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via Shh).

28. Material e métodos • 1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em mononucleares isolados da lâmina própria intestinal. • Células mononucleares da lâmina própria intestinal (LPMC) são isoladas de biópsias endoscópicas ou tecido cirúrgico • Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) serão separadas por centrifugação de 20 ml de sangue em gradientes de Ficol-Hypaque. • As LPMC e as PBMC isoladas serão analisadas a fresco e em culturas estimuladas com fatores de crescimento (IL-2, através do receptor de linfócitos T (TCR), utilizando anti-CD3, com ou sem co-estimulação com anti-CD28, e a exposição a produtos bacterianos (LPS).

29. Material e métodos • 1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em mononucleares isolados da lâmina própria intestinal. • As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à expressão de proteínas da via Shh. • LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro (mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. Primers especificos para Shh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhados. • Western blot e imunohistoquímica/imunofluorescência de slides de cytospin com LPMC.

30. Material e métodos • 2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII • 2.1 analisar a expressão de citocinas e fatores angiogênicos. • Sobrenadantes de cultura de órgãos ou de culturas de LPMC, tratados por 24 horas com peptídeo Shh amino-terminal, ou do anticorpo anti-Shh, ou de ciclopamina, serão coletados para a análise de citocinas (IFN-g, TNF-alpha, IL-17 e IL-10, VEGF e TGFβ) por meio de ELISA.

31. Material e métodos • 2.2 analisar proliferação e apoptose de células mononucleares isoladas da lâmina própria intestinal tratadas com adição ou bloqueio de Shh. • As LPMC isoladas são colocadas em cultura na presença ou ausência do peptídeo biologicamente ativo Shh amino-terminal (5 e 20 ug/ml), ou do anticorpo anti-Shh (50 e 2500 ug/ml), ou de ciclopamina (5uM), um inibidor especifico da via Shh, com ou sem estimulação adicional. • Para a análise da proliferação celular utilizaremos marcador intracelular (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit). Após a marcação as células são colocadas em cultura sem estimulação ou com anti-CD3 mAb (OKT3; 10 µg/ml), anti-CD28 (5µg/ml) e IL-2 (20 U/ml). • No quarto dia, as células coletadas serão analisadas por citometria de fluxo. Para a avaliação da viabilidade celular e fases precoce e tardia de apoptose, células serão marcadas com Annexin-V/7-AAD Kit .

32. Material e métodos • 2.3 analisar as vias de sinalização que regulam a transdução de Shh. • Para a avaliação das vias de sinalização que regulam a transdução de Shh, trataremos células em cultura com os inibidores LY294002, da phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase), ou PD98059, da mitogen-activated protein kinases (MAPK), na presença ou ausência de anti-CD3+anti-CD28, IL-2, ou LPS. Lisados celulares serão analisados por Western blot para a avaliação dos níveis de pAkt, p38, pErk, e de Shh.

33. Material e métodosAnálise estatística • Os dados obtidos em cada etapa do projeto serão armazenados em planilhas diferentes para posteriormente serem analisados com o auxílio de um programa de análise estatística por computador (SPSS for Windows). • Será realizada estatística descritiva para cada variável de desfecho. Os resultados de diferentes grupos serão comparados pelo teste-t, ou pelo teste t-pareado para comparações antes e após tratamento, ou de áreas acometidas e não-acometidas dos mesmos indivíduos, e por tabelas de contingência, ou por ANOVA com comparações múltiplas pareadas. • Coeficientes de correlação serão utilizados para análise de variáveis numéricas quantitativas. O nível de significância será estabelecido em p<0,05.

34. Resultadospreliminares • 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa intestinal de pacientes com DII • 1.1 localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh na mucosa intestinal. •  técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh N-19, e anti Gli1)  A análise das lâminas foi feita ao microscópio óptico, com o auxílio de um programa computadorizado para captura e análise de imagens •  estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via Shh) : 36 casos (11 pacientescontrole/ 11 com DC e 14 com RCU) de lâminasjácortadas

35. ResultadospreliminaresimunohistoquimicaShh - controle

36. ResultadospreliminaresimunohistoquimicaShh - DC

37. ResultadospreliminaresimunohistoquimicaShh - DC

38. ResultadospreliminaresimunohistoquimicaShh - RCU

39. ResultadospreliminaresimunohistoquimicaShh - RCU

40. Resultadospreliminarescontagem de células % de célulaspositivasnatotalidadedalâminaprópria 17.6 9.6 4.5 P<0.046 entre grupocontrole e DC

41. Resultadospreliminaresimunohistoquimica Gli1 - controle

42. Resultadospreliminaresimunohistoquimica Gli1 - DC

43. Resultadospreliminaresimunohistoquimica Gli1 - DC

44. Resultadospreliminaresimunohistoquimica Gli1 - RCU

45. Resultadospreliminaresimunohistoquimica Gli1 - RCU

46. Resultadospreliminarescontagem de células % de célulaspositivasnatotalidadedalâminaprópria 29.5 22 10.7 P<0.02 entre grupocontrole e DC

47. Resultadospreliminares • Shh – marcaçãoperiférica

48. Resultadospreliminares • Gli 1 – marcação forte nuclear

49. Resultadospreliminares • Sabemos que a via hedgehog encontra-se presente na homeostasia dos enterócitos de cólon adulto e nos linfócitos T. • Marcação do Anti-Gli 1 é nuclear e Anti Shh é periférica. • Nas lâminas analisadas de cólon com Doença de Crohn marcadas com Anti Shh e Anti Gli1 observam-se maior marcação na lâmina própria, assim como na RCU, ou seja há marcação das proteínas da via hedghog nas células mononucleares que encontram-se aumentados nessa patologia e também nas bases das criptas. • A demonstração do aumento da expressão da via Shh na mucosa intestinal apóia a hipótese do aumento da proliferação celular das LPMC e ainda sustenta o fenômeno de angiogênese local.

50. Material e métodos • 1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em mononucleares isolados da lâmina própria intestinal. • As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à expressão de proteínas da via Shh. • LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro (mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. Primers especificos para Shh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhados • 15 amostrascoletadas (8 controles, 4 RCU e 3 DC)