蛋白质功能分析技术

1. 蛋白质功能分析技术 徐 炎 10-21-09

2. 一、Western blot: 二、免疫荧光技术： 三、免疫组织化学技术： 四、蛋白质与蛋白质相互作用研究： 1、GST-融合蛋白实验； 2、蛋白质免疫共沉淀技术： 3、酵母双杂交技术： 4 Gel filtration: 5、蛋白质芯片技术：

3. 一、 Western Blot 1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。

4. SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影。 2 操作过程：

5. 3 注意的问题 （1） 蛋白质电泳 • 常用SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质 • 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 • Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。

6. （2）转膜 • 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 • 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 • 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 • 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 • 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择 • 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率。

7. （3）封闭 • 用5％脱脂奶粉或3％BSA • （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） • 时间：室温2h或4ºC过夜

8. （4）显色或显影 • 显色 • 辣根过氧化物酶：底物为DAB • 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT • 化学发光显影 • 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） • 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次 • 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定

9. （5）膜的再利用 • 化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的 －2ME ） 用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。 • 碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交。

10. （6）大量PVDF膜纯化抗体 1) 用无水甲醇浸润PVDF膜。 2) 将纯化好的包涵体抗源蛋白直接点在膜上或者将包涵体溶于8M尿素中以后点在膜上。（注意：蛋白浓度应达到约为0.1 mg/cm2） 或者：跑蛋白电泳后将蛋白转至PVDF膜，用丽春红染色以后，切下目的蛋白条带。 3）在垂直混合仪上，用Glycine buffer处理膜5分钟 4）1 TBS缓冲溶液清洗膜两次, 每次五分钟

11. 5）BSA Blocking Reagent对PVDF膜进行封闭一小时。 6）1 TBS缓冲溶液清洗PVDF膜两次,每次两分钟。 7）将待纯化血清用1 TBS缓冲溶液稀释4倍，加入封闭过的PVDF膜室温孵育2-3小时,或者4度过夜。（这一步最好把PVDF膜切为小块以保证最大的结合效率。可考虑加入100 μl 粗血清/ cm2 PVDF膜）

12. 8) 保留上清, 室温下用1 TBS缓冲溶液清洗PVDF膜两次, 每次两分钟。 9) 洗脱: Glycine buffer与PVDF膜室温孵育两次，每次10分钟。合并洗脱液, 每1 ml洗脱液加Neutralization Buffer 30-40ul起中和作用, 尽快使最后的溶液pH值达到中性。 10) 通过Western Blot检查抗体的纯度和适合的工作浓度以后, -80度贮存纯化的抗体。或者，加甘油至浓度50%, -20度储存纯化的抗体。

13. Known biochemical function of CSN is de-neddynation from Cullins type E3 ligase in eukaryotic organisms

14. The reduction of CSN complexes increases the Neddylation -cullins in CSN3 Co-supp. line CO WT ＊ anti-Cullin1 ＊ anti-Cullin4 anti-Rpt5

15. 二 、免疫荧光技术 利用某些荧光素，通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。

17. 、荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）。 蛋白质或其他分子在活细胞内互相结合的时间和地点是了解它们的功能的关键问题。要回答这一问题，将蛋白质标上不同的荧光团。但是，光学显微镜的光学分辨率将蛋白质探测精度限制到大约0.2μm左右。要研究蛋白质成分的相互物理作用，需要较高的分辨率。

18. 1.什么是FRET？FRET就是采用非放射性方法，在供体和受体相互靠得很近（1-10 nm）时，将光子能从一个受激励的荧光团（供体）转移到另一个荧光团（受体）。 采用FRET，可以解决超过光学显微镜光学显微限度的分子相对邻近度问题，来显示（例如）（1）二个蛋白质成分间分子相互作用；（2）一个分子内部（如酶活动能力、DNA/RNA形态）的结构变化；（3）采用象CFP-YFP Cameleon这样特别的FRET-工具的离子浓度。

19. 2. FRET原理： 受激励后的荧光团（供体）将受激励的静能转移到一个光吸收分子（受体）。这种能的转移是非放射性的，其主要原因是供体和受体之间的偶极-偶极间的相互作用。

20. 二、生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）1、BRET原理：这个技术同样是建立在能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白的突变体GFP）之间会发生能量转移。例如，在一些海洋生物（如水母Aequorea victoria和海参R. reniformis）中自然发生一种能量转移现象――生物发光共振能量转移。在这个过程中，Renilla的荧光素酶（Rluc）在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光（480nm），能够转移能量到GFP的突变体上[增强的黄色荧光蛋白(EYFP)], 随之后者发出530nm的绿光。

21. 这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者的相互关系来进行评估。它们间的能量转移只有在Rluc和EYFP的两个融合蛋白接近到足够近（<100 A°）的距离时才能发生。BRET的信号可以通过比较EYFP发出的绿光和Rluc发出的蓝光的量来进行测量。因为BRET信号是一个比率数，不是一个绝对量，它消除了那些因为由于细胞数、细胞类型和其它实验变量而引起的数据变量。

22. 三、双色荧光互补实验（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）。BiFC) 分析技术，是一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术. 该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用. 其后发展出的多色荧光互补技术 (multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.

23. 目前，该技术已用于转录因子，G 蛋白 β γ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上.1、BiFc原理：GFP家族有一重要性质——循环排列。GFP、YFP、CFP和 BFP都是由 238 个氨基酸组成的单体蛋白质, 荧光的产生主要归功于分子内第 65、66、67 位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸自环化形成生色团的功效。

24. Degradation of DELLA

25. GID1c–YFPC + YFPN–RGA DAPI YFP

26. GID1c–YFPC + YFPN YFP DAPI

27. YFPC + YFPN–RGA YFP DAPI

28. 三、免疫组织化学技术 • 原理： • 是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙的结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜等）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。

29. 四、蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术

30. 1、GST融合蛋白进行Pulldow实验 原理: 细菌表达的谷胱甘肽s－转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

31. 两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用. 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 .

32. （2）方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白）。 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4ºC 2h。 3）离心弃上清。 4）沉淀加入2× 蛋白Loading Buffer煮沸，离心。 5）取上清进行SDS-PAGE电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确 定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白。 • 该实验设立GST对照，反应均在4ºC进行

33. 2 免疫共沉淀 原理： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档. 缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用.

35. （3）注意的问题 1）细胞裂解: 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质。 相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktail。 2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。 3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗. 兔多克隆抗体：正常兔IgG.

36. 免疫共沉淀(适用于抗体已经结合到beads上或者有商用的beads，如常见tag的beads)免疫共沉淀(适用于抗体已经结合到beads上或者有商用的beads，如常见tag的beads) 1) 收集一满管（1.5 ml）约3-7天的幼苗或花（约300～500mg），用液氮速冻后提取蛋白或者在-80℃长期保存。 2) 用液氮预冷研钵，组织倒入研钵中，液氮快干时开始研磨，磨成细粉加液氮，快干时再磨，重复三到五次；收集植物组织细粉于1.5ml管中，管中事先加入加400~600ul IP Buffer并放在冰上预冷，Buffer的多少大体与组织重量成正比。

37. 3)（step 2 的替代方案：加400-600 μl IP抽提缓冲液于研钵中，用研钵和杵研磨组织，直到研磨均匀，转移到1.5 ml管中）。 4) 14,000 rpm，4℃离心15 min； 5) 将上清转到一个新的管子里，14,000 rpm，4℃离心15 min； 6) 将上清转到一个新的管子里。紫外分光光度计测量OD595nm，根据标准 线计算出各样品的蛋白浓度，需要在一起平行实验的样品蛋白浓度调成 样。 7) 取20 μl到新管子中作为总蛋白对照（简称T, 可略多取，由电泳时需要 样量决定），加适量SDS上样缓冲液，煮沸5～10 min，其余部分留着与beads结合；

38. 8) 将结合好抗体的protein A-琼脂糖微珠用同样的IP 缓冲液洗2-3遍。 9) 取相同体积蛋白抽提液与protein A-琼脂糖微珠混合。再用IP 缓冲液补到最终体积为1.5~2ml,用4~6 ml的管子(补充IP buffer的目的是维持buffer的缓冲体系，植物组织中的液体可能将buffer浓度改变了)。 10) 在4℃温和地摇4 hr（目的蛋白较稳定但是结合效率低的情况下可4℃过夜）；若觉得蛋白有降解可能，取部分抽提液不加抗体摇相同时间做为负对照，正常实验时不需要此对照。 11) 3,000 rpm，4℃离心2-3 min。用同样的IP 缓冲液洗3-5遍，每次中间摇5-10 min； 12) 最后弃去上清，加50～60 μl 2X SDS上样缓冲液，煮沸10～15 min。（可在-20℃长期保存）

39. SDS-PAGE • 根据所需检测蛋白大小选择合适的分离胶浓度； • 若需要所得蛋白条带较窄，浓缩胶不应短于0.5cm； • 上样前用水冲洗加样孔，上样时保证每个孔上样量一致，若有区别用1×loading buffer补平（如样品最多的要上20ul，不上样的孔加20ul 1×loading buffer，只有5ul样品的先加15 ul 1×loading buffer混匀再上样）； • 等压跑胶，浓缩胶所用电压50~80V，分离胶100~160V；

40. 半干转膜（其他方法请参照相应操作手册） • 电泳快结束时，对应每块胶用transfer buffer浸泡旧的厚滤纸两张，新的厚滤纸一张，薄滤纸四张，PVDF膜一张（先用甲醇泡15s，再用水泡，再用transfer buffer泡）； • 电泳结束，卸胶，用transfer buffer泡胶几分钟； • 在半干转膜仪上顺序放上两块旧的厚滤纸，两张薄滤纸，膜，胶，两张薄滤纸，一张新的厚滤纸；放置胶时注意保持不要变形；用玻璃管压出气泡，盖上盖子开始转膜；一般100kD以下蛋白15V 1hr即可转过去。大蛋白需要延长转膜时间，具体效果可以观察marker的转膜情况。

41. Western blotting： • 转膜结束后，标记膜的正反面，用水洗去膜上的残胶，5％牛奶封闭一小时，一抗4℃过夜； • TPBS洗5min 3遍（如果不只一张膜，最好分开洗，避免膜重叠）； • 二抗室温1～2h； • TPBS洗5min 3遍，水洗5min 3遍； • ECL显色液泡3min，暗室中压X光片洗片看结果，调整压片时间得到合适深浅的条带。(避免膜被光照，否则荧光消退较快)。

43. 3 酵母双杂交系统 原理： 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。

44. Gal4激活域 LacZ Gal4结合域 X Gal4结合域 LacZ Gal4激活域 Y LacZ Gal4激活域 Y X LacZ Gal4结合域

45. 用途 1）已知蛋白之间相互作用的检测： 2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸； 3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。

46. Material： Yeast: EGY48 (pEG202); L40 (pJG4-5); Reporter plasmid: pSH18-34; 共转化EGY48,需要用Galactose诱导, Leu (R); 共转化L40，Both Galactose and glucose will be do Lac Z (R) EGY48 (pEG202) and L40 (pJG4-5) mate together, 需要用Galactose诱导, Leu (R) Lac Z (R)

47. 酵母双杂交: pEG-X转入酵母菌株EGY48, pJG-Y转入酵母菌株L40 从要杂交的两个酵母菌株各挑一个菌落，放入含有0.5ml YPD培养基的1.5 ml 管子里，vortex后在30℃ 摇床培养6-18 hr. 将适量的（10-100μl）杂交培养液涂在含2%葡萄糖的SC-His-Trp培养基上。30℃培养2-3d 挑6-8个菌落到含有2%半乳糖（Galactose），1%棉子糖（Raffinose）以及X-Gal (80mg/L) 的SC-His-Trp培养基上，观察菌落是否显蓝色。

48. 酵母双杂交的液体分析（可多做几组取平均值）:酵母双杂交的液体分析（可多做几组取平均值）: 1) 挑6-8个菌落到含有2%葡萄糖的SC-His-Trp液体培养基中，30℃摇床培养过夜; 2) 4000 rpm离心10 min，用含有2%半乳糖，1%棉子糖的SC-His-Trp液体培养基重悬细胞。继续在30℃摇床培养4hr，测量吸收值OD600得到细胞密度; 3) 转移200μl菌液到1.5ml管子里，14000 rpm室温离心20 sec; 4) 用1 ml Z 缓冲液重悬;

49. 5) 加 20μl CHCL3和20μl 0.1% SDS, vortex 10 sec 在28℃放置5 min （温度和与底物反应时相同）; 6) 加200μl 4mg/ml的ONPG水溶液（o-nitrophenyl-β-D-galactoside）。在28℃ 放置5 min; 7) 加 250μl 2M的Na2CO3终止反应; 14,000 rpm 室温离心 5min，除去沉淀; 8) 测量吸收值OD420，与之前所测得的吸收值OD600相比，来计算相对β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性。

50. BD-CSN3 BD AD AD-CSN4 AD-CSN8 AD-CUL4 AD-COP10 AD-DDB1B AD-DDA1 AD-DET1