Virulens/intemperált bakteriofágok

1. Virulens/intemperált bakteriofágok Fág vizsgálati módszerek A T4 fág Más virulens fágok T sorozat ssDNS vírusok RNS fágok Bacillus subtilis fágok

2. Fizikai módszerek • Elektron mikroszkópia • Hibridizálás • heteroduplex analízis • Radioaktív jelölés • Titrálás (plakk) • Egylépéses növekedés (one step growth) • Single burst • Korai lízis (premature lysis) Biológiai módszerek

3. Egylépéses növekedési görbe • Egyidejű fáginfekció • Fág adszorpció gátlás • Növekedést gátló anyag (KCN) • Különböző időkben vizsgáljuk a infekciós centrumok számát (titrálás, plakk) • Három fázisú görbe • Látens fázis • Az infekciós centrum a fertőzött sejt (amely lizál) • Emelkedési szakasz • A sejtek kezdenek lizálni, az infekciós centrumok vagy a kiszabadult virionok, vagy a fertőzött sejtek • Plató • Az infekciós centrum a szabad virion

5. Az átlagos „burst” méret, az egy sejtből kiszabadult virionok száma • A fenti görbéből a plató és látens fázis közötti arány az átlagos „burst size”

6. „Single burst” kísérlet • A fágfertőzést követően a tápközeget higítjuk, hogy egy csőbe csak egy fertőzött sejt kerüljön • Így a lízis után a virionok csak egy fertőzött sejtből származnak • A fertőzési arány (MOI<1) kicsi • Fertőzés után higítjuk a sejteket • A kiszabaduló virionok nem találkoznak gazda sejttel • Nagy különbségek 1-58-ig • Komplex folyamat eredménye a „burst size”

7. Korai lízis (megszakított fertőzés) • Módosított egylépéses növekedés • Mintavétel után lizáljuk a sejteket • Kloroformos rázatás • T6 felülfertőzés (100 MOI), lízis kívülről • Vizsgáljuk a kiszabadult fág részecskéket, vagy fehérje komponenseket • Eklipsz fázis • A növekedési szakasz azon része, amikor nincs fertőző fágrészecske • A fág DNS nem fertőző • A fágrészecskék megjelenése után a részecskék számának növekedése lineáris • Egyenként keletkeznek a részecskék, mint egy gyártósoron (nem osztódás)

9. T4 fág (genetikai analízis) • Mutáció, r+, RII, lízis gátlás<>rapid lízis • Keresztezés • Deléciós térképezés • 2, 3 faktoros keresztezés • Komplementáció • Cisztron, egy komplementációs csoport egy fehérje • Finomtérképezés • Recon: a rekombináció legkisebb egysége, 1 bp • Muton: a mutáció legkisebb egysége, 1bp • A kód 3 bp-os

11. T4 morfológia és összetétel • Ikozaéder fej • Kontraktilis/összehúzódó farok • Farok szálak • A fejben lineáris dupla szálú DNS

14. T4 DNS (morfológia és összetétel) • Hidroximetil-citozin • Metil csoport glükozilált • 70 %  kötéssel • 30 %  kötéssel • Így különbözteti meg a saját és gazda DNS-t

16. Fág heterozigóták • Het • RII mutáns vizsgálatkor 2%-ban „molyhos” plakk, keverék populáció, amely szegregálódik (RII és r+) • Vagy rekombináció eredménye vagy terminális redundancia • Terminális redundancia • Fej nagyobb, mint a DNS • 3 kb-sal több DNS pakolódik • A végen ismétlődik a DNS • Fizikai módszer, DNS denaturálás után „ragadós vég keletkezik”

18. Cirkuláris permutáció • Cirkuláris géntérkép, de lineáris molekula • Mintha egy kör alakú molekulát különböző helyeken vágnánk fel • Random duplex kialakítás • Bizonyíték, hogy a molekula cirkulárisan permutált • A terminális redundancia és cirkuláris permutáció megmagyarázza, hogy miért cirkuláris a géntérkép • Mert nincsen „fix kezdőpontja” a DNS-nek, ezért a géntérképnek sem lehet

20. T4 DNS replikáció • Terminális redundancia • Konkatemerek keletkeznek, melyek a fág fejbe pakolódnak a fej nagysága szerint (több, mint egy genom egység) • Cikuláris permutáció • Rolling circle replikáció jó lenne, de a T4 fág DNS nem cirkularizálódik • Modell • Lineáris molekula replikációja nem teljes • A lagging strand vége nem tud replikálódni, egyszálú DNS marad, ami rekombinogén

22. T4 adszorpció • Farok szálak reverzibilisen kötődnek • Fág mozog a külső membránon • Irreverzibilis kötődés a fág receptoron • Adhéziós zóna (belső, külső membrán összeér) • Farok összehúzódik • Proton transzfer segítségével bejut a DNS

23. T4 szabályozás • Szigorú szabályozás kell a megfelelő „burst size” eléréséhez • Immediate early, early, middle, late gének • Bekapcsolás a promóterek fizikai szeparációjával (késeiek a 3’ vég felé) • Antiterminációval, azaz a termináció gátlásával

25. A T4 átveszi az irányítást • A gazda DNS degradációja • Saját DNS replikációjának az alapanyaga • HMC (hidroximetil-citozin) szintézis • E. coli-ban nincs hasonló • Citozin beépülésének megakadályozása • T4 dCTPáz, bontja dCTP, dCDP, dCMP keletkezik, ami nem épül be a DNS-be • A T4 DNS glükozilálása • HMC-t a coli megtámadja • HMC glükozilálódik T4 enzimek által, ezt nem támadja meg a coli endonukleáz • RNS polimeráz módosítás (T4 szigma faktorok)

28. T4 fágrészecskék termelése • Fág alkotórészek szintézise • Fej, farok • Ahogy a premature lízisből látszott a fej, farok szintézise független folyamat • A vírusrészecskék száma lineárisan nő, mintha „gyártósoron” készülnének • Fej szintézisében chaperon fehérjék • Fág DNS pakolás • Fejméretű pakolás, endonukleáz hasítás, termináz enzim • Spirális összecsomagolás (ion etching-el kimutatva) • Gazdasejt lízis, fágspecifikus lizozim enzimmel

32. Más virulens fágok • T sorozat • Delbrück 7 különböző fágot választott • Elektronmikroszkóppal a T párosak és T páratlanok hasonlítottak egymáshoz • T páros, kontraktilis farok, hosszúkás fej • T páratlan, nem kotraktilis farok, oktaéderes fej

33. T2, T6 fágok • A T4 fággal homológok • HMC glükoziláció különbözik • T2 25% nem glükozilált, di-glükozidok (minkettő ) • T6 di-glükozidos, az első , a második  glükozidos kötéssel • 85% homológia • T2 host range mutáció • Farok szálak módosulnak • E. coli mutálódhat • T3, T7-nél host range mutációra rezisztens baktérium • T2 farok szál poszt-transzlációsan módosul (180 AA levágás a C-terminálisról • Ha hiányzik a szignál a fehérjéről, akkor nincs módosítás

34. T1 fág • Legkorábban használt fág (Luria-Delbrück fluktuációs teszt) • Perzisztens, nehéz kiirtani, mindenhol megjelenik, ezért nem vizsgálták • Valószínű a  fág virulens mutánsa • T1 fág mutánsok története (PCR hasonló)

35. T5 fág • T1-hez hasonlít, kevesebb farok szál (4) • Nagy (9%) terminális redundancia • Nick-ek a DNS-en több 4-5-ös sorozatban • Gének szabályozása (5’-től a 3’-ig, pre-early, early, late) • A pre-early gének jutnak be előbb • DNS bejutás megáll • Csak akkor indul újra, ha a már bejutott gének FST (first step transfer) expresszálódnak • Néhány T5 promóter nagyon erős (90% az össz transzkripciónak innen indul), 7-metil-guanozin (CAP), klónozó vektorokban használt

36. T7, T3 • T7 RNS polimeráz csak a saját promóterét ismeri fel • T7 promóter egy része nagyon konzervált így valószínűtlen, hogy máshol is előfordul • Klónozó vektorokban használják, mert a T7 promóterről csak akkor van átírás, ha a T7 polimeráz is a sejtben van • T7 terminálisan redundáns, de cirkulárisan nem permutált (hasítás restrickiós enzimhez hasonló) • Fejméretű pakolás nem magyarázza az egyedi DNS molekulát

37. Egyszálú DNS-t tartalmazó fágok(Ff, filamens fág csoport) • Cirkuláris egyszálú DNS (~6 kb) • Hosszúkás alak, melyben a DNS köré sok azonos alegységű fehérje tekeredik • F pílushoz tapadnak a virionok (male specifikus fágok)

38. Ff DNS replikáció • RNS priming • RF IV forma kovalensen zárt cirkuláris • RFI supercoiled RF IV • RFII nick a DNS-en • Komplementer szál szintetizálódik • Az eredeti szál áthelyeződik • SSB (egyszálú DNS kötő fehérje) stabilizálja • „pakolódik” • Kijutás szignál peptid akcióként, nincs lízis • Nagy titer 1012 /ml, plakk lassúbb növekedésű rész

40. M13 fág • lacZ gén beépítése a klónozáshoz • Restrikciós helyek a klónozáshoz • Primer hely • RF használható, mint egy plazmid klónozás • Egyszálú DNS szekvenáláshoz használható

41. X174 • Sejt lízis • Kis genom méret, egymásba ágyazott gének

43. RNS fágok • Lineáris egyszálú RNS • Male specifkus fágok, píluson keresztül • Nagy reverziós ráta, mert az RNS szintézis pontossága kisebb • Transzlációs csatolás • RNS másodlagos szerkezetéből adódik (replikáz csak a köpenyfehérje transzlációja után indulhat • RNS replikációhoz 4 fehérje szükséges • 3 gazda fehérje mely az RNS transzlációs rendszerben található • Virális replikáz • Ez a komplex az RNS függő RNS polimeráz, két lépcsős replikáció, először a + szál, majd a – szál szintetizálódik

46. Bacillus subtilis fágok • SPO1 • T4-hez hasonló morfológia • Terminálisan redundáns, de egyedülálló szekvencia • Timin helyett 5-hidroxi-metil-uracilt tartalmaz • A gazda RNS polimeráz megváltozik a fág szigma faktorok hatására • 2 replikációs origó van, 20x genomnyi konkatemer jöhet létre • A gazda sporulációja gátolja a SPO1 fejlődését, ezért az endospórában virális DNS található, amely lehetővé teszi a szaporodást

47. 29 • Kisméretű dupla szálú DNS, gyűrűs • Két korai gén a DNS két végén (cirkuláris DNS!) • DNS középső részén • Az átmenet a gazda transzkripcióból a fág transzkripcióba, fág szigma faktorok termelődése révén valósul meg

48. Összefoglalás • Fág vizsgálati módszerek • T4 fág • T sorozat fágjai • Egyszálú DNS fágok • RNS fágok • Bacillus fágok