Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique: 
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Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps », PowerPoint PPT Presentation


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Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique:  optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques. Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps », Centre de Recherche des Cordeliers/INSERM U.872) [email protected]

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Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps »,

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Presentation Transcript


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique: optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques

Jean-Luc Teillaud

(Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps »,

Centre de Recherche des Cordeliers/INSERM U.872)

[email protected]


Les anticorps monoclonaux 37 ans d histoire

Publication de la technique d’obtention des anticorps monoclonaux (AcM): Köhler & Milstein, Nature, 256: 495, 1975

Premier AcM mis sur le marché (1986) :

Muromonab (anti-CD3, souris)

Derniers AcM mis sur le marché (2011) :

ipilimumab (anti-CTLA-4), belimumab (anti-BLyS/BAFF)

* 27 AcM ont actuellement une AMM [ USA (FDA) et Europe (EMA)]

Les anticorps monoclonaux: 37 ans d’Histoire


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Lymphocyte B Hybridome

ARNt/ARNm

VL

VH

ADNc

Génération d’un AcM recombinant huIgG, 

AcM, HuIgG,

Vecteur(s) avec séquences huC et huC

Transfection

Clonage

Lignée cellulaire (CHO, NS1…)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

VH

VH

Fab

VL

VL

CH1

CH1

CL

CL

Fixation au FcRn

CH2

CH2

Fc

Fixation aux FcR

CH3

CH3

Fixation à l’Ag

Dualité fonctionnelle des anticorps (IgG1)


Modes d action des acm usage th rapeutique

  • Neutralisation de l’interaction ligand soluble-récepteur (Ac anti-ligand, anticorps anti-récepteur): TNFa, IL1b, VEGF, IL6-R, EGF-R, CD25 (IL2-Ra), FceRI, toxine (charbon), C5

  • Blocage de l’activation d’un récepteur (HER2/Neu, EGF-R)

  • Blocage de l’interaction cellule-cellule (CD11a, intégrine a4)

  • Induction d’apoptose (CD20)

  • Ciblage d’une drogue (CD33-ozogamicine*)

  • * Retiré du marché

Modes d’action des AcM à usage thérapeutique


Modes d action des acm usage th rapeutique1

  • Activation de mécanismes effecteurs via la région Fc (ADCC, CDC, phagocytose, production de cytokines ou/et de chimiokines) (CD20, CD52)

  • Induction d’une immunomodulation par blocage de molécules membranaires impliquées dans la co-stimulation ou son contrôle (CD4, CTLA-4)

  • Induction d’une réponse immune adaptative cellulaire à long-terme

Modes d’action des AcM à usage thérapeutique


L anticorps murin qui voulait tre humain

  • L’infusion d’AcM de souris chez l’Homme => anticorps humains anti-Ac de souris (HAMA)

  • => neutralisation et clairance accélérée de l’AcM => chute de l’efficacité,

    • effets secondaires dus à la formation de complexes immuns et

    • à leur dépôt.

  • Les AcM de souris ne stimulent pas les fonctions effectrices de l’immunité de façon optimale chez l’Homme :

  • => faible activation du complément,

  • => mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc des Ig (RFc) et du RFcn (=> diminution de la T1/2).

«L’anticorps murin qui voulait être humain»


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Transformation

Donneur

Immunisé

Lignées B

(EBV)

Lymphocytes B

du sang périphérique

EBV

Criblage

Ac1

Ac2

AcM

Ac3

Clonage des cellules

Ingénierie cellulaire pour générer des AcM humains

1977 : Transformation par l’EBV de lymphocytes B pour produire des AcM (Steinmitz et al., Nature, 269: 420, 1977)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Ingénierie moléculaire pour générer

des anticorps humains

1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)

1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)

1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)

1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)

1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)


De la souris l homme

De la souris à l’Homme…

AcM de souris

AcM chimérique

Domaine Ig de souris

Domaine IgG humaine


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Ingénierie moléculaire pour générer

des anticorps humains

1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)

1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)

1989 : AcM humanisés(Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)

1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)

1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)


De la souris l homme1

De la souris à l’Homme…

AcM de souris

AcM humanisé

DomaineIg murin

Domaine Ig humain

CDRs murin


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Hybridome B de souris

ARNt/ARNm

Séquençage

Comparaison V humains

Modélisation 3-D/cristal

Détermination CDR/FR

contact

Greffe CDR

Mutations ponctuelles FR

AcM, HuIgG1,

VL

VH

huVL

huVH

Transfection

Clonage

Génération d’un AcM recombinant humanisé huIgG1, 

Lignée cellulaire (CHO, NS1…)

Vecteur avec séquences huC1 et huC


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Humanisation d’un AcM recombinant

Substitutions d’a.a. des FR humains impliqués dans des contacts avec des a.a. des moCDRs greffés: remplacement des a.a. «humains» par les a.a. trouvés à la même position sur les VH/VL murins de l’Ac de souris («FR back mutations»)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Ingénierie moléculaire: anticorps humains

1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)

1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, eFv) dans E. coli(Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)

1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)

1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)

1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)


Expression bact rienne de fragments d anticorps les single chain fv scfv

VH

Espaceur

VL

(GGGGS)3

VHa

VLa

Etiquette

Fv

P

rbs

L

Stop

Espaceur

VLa

VHa

Etiquette

scFv

Expression bactérienne de fragments d’anticorps: les « single chain Fv  (scFv) »


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Ingénierie moléculaire: anticorps humains

1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)

1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)

1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)

1989: Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)

1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Banques combinatoires de phages

Phage filamenteux

pIII

scFv


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display »)

1. Clonage et expression de régions Fab ou de scFv humains => production d’une banque de phages

2. Sélection de Fab ou de scFv spécifiques exprimés à la surface des phages

3. Isolement des VH/VL spécifiques et «reformatage» sous forme d’IgG entière

4. Transfection et production de l’AcM recombinant dans des cellules eucaryotes (CHO, NS1…)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

VL

VH

Banques combinatoires de phages

Lymphocytes B

humains

ARNt/ARNm

ADNc


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

1. Adsorption

2. Lavage

3. Elution (pH acide)

Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display »)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Phage sélectionné

PCR

huVL

huVH

Génération d’un AcM recombinant humain

IgG1, à partir d’un phage sélectionné

AcM, HuIgG1,

Vecteur avec séquences huC1 et huC

Transfection

Clonage

Lignée cellulaire (CHO, NS1…)

ADNc


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

*

**

*

*

*

*

Phage display: génération de fragments d’Ac mutés

1. Phage parental

3. Banque de

Phages mutants

Purification

de l’ADN wt

scFv ou Fab

2. Mutagenèse


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

*

*

*

Phage display: sélection de fragments d’Ac de forte affinité

Banque de

phages mutés

Phage muté

sélectionné

(forte affinité)

  • Adsorption sur l’Ag

  • (faible densité)

2. Lavage

3. Elution


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Ingénierie moléculaire: anticorps humains

1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984)

1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988)

1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989)

1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989)

1994: Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Génération d’AcM humains: utilisation de souris transgéniques humanisées contenant les gènes d’Ac humains


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Invalidation

des gènes DJ & J

(chaînes H & L)

de souris (lignée A)

2. Insertion des gènes codant une partie des chaînes lourdes et légères humaines (YAC) (lignée B). Croisement (AxB) => souris « humanisée »

3. Production d’hybridomes après immunisation

4. Clonage de l’AcM

humain et expression

dans des cellules

eucaryotes (CHO, NSO …)


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Immunogénicité des Ac recombinants

Ac chimériques:

Dépend de l’Ac chimérique: pas, peu ou fortement immunogène(Homologie plus ou moins forte avec les VH/V humains?)

2. Ac humanisés:

Peu immunogène mais dépend également de l’Ac considéré

Pour tous les Ac recombinants:

Rôle de la voie d’injection?

Rôle des doses injectées et de leur nombre/fréquence?

Rôle de l’antigène ciblé?

Test de détection des HAMA utilisé!


Les 27 acm utilis s en clinique en 2012 fda emea

- 2 AcM sont des IgG de souris (une IgG1, une IgG2a)

- 4 AcM sont des IgG1 humaines chimériques

- 9 AcM sont des IgG humanisées (dix IgG1 dont deux

Fab, deux IgG4, une IgG2/4)

- 9 AcM sont des IgG humaines (sept IgG1, deux IgG2)

- 1 Ac bi-spécifique (rat IgG2b/souris IgG2a)

- 2 Fab (un chimérique PEGylé, un humanisé)

Les 27 AcM utilisés en clinique en 2012 (FDA+EMEA)

* Juin 2012


Les acm utilis s en clinique fda emea chine

33 AcM sont/ont été sur le marché* et ont généré des revenus de près de quarante milliards d’Euros en 2011:

- 8 AcM dans les maladies inflammatoires/auto-immunes

- 1 AcM dans les maladies infectieuses (VRS)

- 3 AcM dans la transplantation

- 1 AcM dans les maladies cardio-vasculaires

- 1 AcM dans une maladie neuro-dégénérative (SEP)

- 1 AcM dans l’asthme allergique

- 15 AcM en oncologie

- 1 Acm en ophtalmologie (DMLA)

- 1 AcM dans les maladies osseuses

-1 AcM en hématologie (HPN)

Les AcM utilisés en clinique (FDA+EMEA+ Chine)

* Juin 2012


Quelques r gles de lecture propos des acm

NomType Ex. d’anticorps

xxmOmabMouse muromonab

(souris)britumomab

xxXImabChimeric rituximab

(chimérique)cetuximab

XXZUmabHumanized trastuzumab

(humanisé) alemtuzumab

XxmUmab Fully Human panitumumab

(humain) adalimumab

Quelques règles de lecture à propos des AcM


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Optimiser les anticorps monoclonaux

*Optimisation de la fixation des AcM et des effets biologiques induits sur la cible :

- affinité et avidité

- spécificité «fine»: choix de l’épitope

(effets pro-apoptotiques, cytostatiques …)

*Optimisation des fonctions effectrices :

- meilleurs recrutement et activation des

cellules effectrices [cellules NK, neutrophiles, monocytes/ macrophages, CTLs (anticorps bispécifiques, «T-bodies»)]

- meilleure activation du complément (C1q)

(voie classique: IgG3> IgG1, IgG2)

=> formation du Complexe d’Attaque Membranaire


Acm optimis s les anticorps bisp cifiques bsab

Lyse

BsAb

Ag cible

Cellule cible

(A)

Lyse

AcM optimisés: les anticorps bispécifiques (BsAb)

BsAb

Phagocytose

Ag cible

Cellule cible

Molécule de

stimulation

Cellule effectrice

(B)

Drogues

Cytokines

Vecteurs

Haptènes bivalents


Anticorps bisp cifique 1 ing nierie cellulaire quadromes

Fusion

Sélection

(Milstein & Cuello, Nature, 305, 537-540, 1983)

Anticorps bispécifique: 1. Ingénierie cellulaire (quadromes)

BsAb


Anticorps bisp cifique 2 ing nierie biochimique mdx 260 anti cd64 anti g d2

Anticorps bispécifique: 2. Ingénierie biochimique (MDX-260, anti-CD64/anti-GD2)

Q représente le N-éthyl succinimidyl; R, le O-phénylène-dissuccinimidyl


Anticorps bisp cifiques 3 ing nierie mol culaire

VH

Espaceur

(GGGGS)3

VL

VHa

VLa

Etiquette

Fv

P

rbs

L

Stop

Espaceur

Espaceur

Espaceur

VLa

VLb

VLa

VLa

VLa

VHa

VHa

VHb

VHa

VHa

Tag

Etiquette

Etiquette

Etiquette

scFv

“Diabody” bivalent

“Diabody” bispécifique

Anticorps bispécifiques: 3. Ingénierie moléculaire


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Génération et ingénierie de fragments d’Ac

1989: Isolement de domaines VH ayant de fortes affinités à partir de banques de domaines VH exprimés dans E. coli(Ward et al, Nature, 341:544)

1993: Ac intracellulaires (“Intrabodies”) (Marasco et al, PNAS, 90:7889) et fragments Fc à usage thérapeutique (Debré et al, Lancet, 342:945)

1993: Ingénierie moléculaire de formats bispécifiques: “diabodies” (Holliger et al, PNAS, 90:6444), “triabodies”….

1993: Découverte d’Ac de Camelidædépourvus de chaînes légères (Hamers-Casterman et al, Nature, 363:446)

2008: Régression tumorale chez des patients cancéreux après injection de très faibles doses de fragments d’Ac bispécifiques (Bargou et al, Science, 321:974)


Expression de single chain fv scfv la surface de cellules de mammif res

Expression (« Hooking »)

Espaceur

TM ± région IC

(GGGGS)3

Expression + transduction

(« T-bodies »)

Expression de «single chain Fv  (scFv)» à la surface de cellules de mammifères

VHa

VLa

Tag

P/O

L

Stop

Espaceur

VLa

VHa

TM ± IC

Tag

scFv-TM-IC


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Anticorps bispécifique de lama VHH: ciblage du RFcIII/CD16 et d’un antigène associé aux tumeurs (ACE)

VHH (anti-ACE) - huC

VHH (anti-RFcIII) - huCH1

Fab-like (bispécifique)

Cellule NK

RFcIII

ACE

Cellule tumorale

VHH Ab

bispécifique


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Utilisation de fragments scFv comme «intrabodies»

L’expression intracellulaire d’un scFv anti-ras neutralisant à l’aide d’un vecteur viral induit la régression tumorale dans des souris nude (HCT 116)

Espaceur

VLa

VHa

Tag

scFv


Anticorps monoclonaux optimis s ing nierie de la r gion fc igg1

Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)


Fonctions effectrices des igg d pendantes des r cepteurs pour la r gion fc des igg rfc

Fonctions effectrices des IgG dépendantes des récepteurs pour la région Fc des IgG (RFc)

* Fixation aux RFc activateurs (I, IIA, III):

* La cytotoxicité dépendante d’anticorps (ADCC)(cellules NK, monocytes, neutrophiles)

* La phagocytose de particules opsonisée (DC, (macrophages)

* L’endocytose de complexes immuns (monocytes, DC, macrophages, neutrophiles, lymphocytes B)

* La sécrétion de cytokines et chimiokines

* Fixation aux RFc inhibiteurs (IIB) : blocage de l’activation cellulaire induite par d’autres récepteurs (BCR, RFc, RFc activateurs…) (lymphocytes B, mastocytes, monocytes…)


Anticorps monoclonaux optimis s ing nierie de la r gion fc igg11

Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)

Stratégies d’ingénierie de la région Fc :

1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1

ayant une région Fc mutée

2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

WT

Sélection de mutants IgG1 ayant une fixation accrue au RFcIIIA et présentant une plus forte ADCC

Stratégie: mutagenèse dirigée de tous les acides aminés exposés aux solvants dans les domaines CH2 et CH3 d’une IgG1 humaine (anti-HER2/Neu, trastuzumab)

Mutants >WT ( FcRIIIA binding)*

T256A

K290A

S298A

E333A

K334A

A339T

S298A/E333A

S298A/K334A

S298A/E333A/K334A

* Numérotation «Eu»(Shields et al., J. Biol. Chem., 2001)

AICC


Anticorps monoclonaux optimis s ing nierie de la r gion fc igg12

Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)

Stratégies d’ingénierie de la région Fc :

1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée

2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Cpm

G0

G1

G1F

G2F

m/z

(courtesy of L. Krummen, Genentech, Inc., USA)

Glc NAc

Mannose

Galactose

Fucose 1,6

NeuAc 2,6

Hétérogénéité de la glycosylation des AcM


Ing nierie de la glycosylation igg1 humaines

Ingénierie de la glycosylation (IgG1 humaines)

L’absence de fucose ou un contenu faible en fucose (20-35%),

La présence de galactose et/ou de galactose et d’acide sialique à l’extrémité de/des GlcNAc terminales,

La présence d’une GlcNAc intercalaire,

accroissent la fixation aux RFc

et augmente l’ADCC des IgG1 monoclonales humaines


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

Les anticorps monoclonaux optimisés

* Optimisation des propriétés pharmaco-cinétiques

* Meilleure bio-distribution et ciblage (notamment au site de la tumeur)

* Meilleure capture de drogues, vecteurs viraux, et haptènes radio-marqués au voisinage de la cellule-cible (dans la plupart des cas, des cellules tumorales)


Les nouveaux d fis des anticorps monoclonaux

  • Un, deux, trois AcM (bio-terrorisme, oncologie…)?

  • - Les anticorps conjugués aux drogues (immunoconjugués): le grand retour de la “magic bullet”?

  • Les nouveaux formats (Ac bi- ou tri-spécifiques, simples domaines VH, VHH…?

  • Nouvelles utilisations: anticorps intra-cellulaires, fragment d’Ac à la surface de cellules effectrices (« T-bodies ») ou cibles (« Hooking »): AcM et thérapie cellulaire?

  • Qu’est ce qu’un biosimilaire?!

Les nouveaux défis des anticorps monoclonaux


Jean luc teillaud equipe 14 biotechnologie des anticorps

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