“ Chemiotassi verso sostanze aromatiche tossiche in batteri utili per processi di biorisanamento ambientale ”

1. Università degli Studi “ROMA TRE” Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Dipartimento di Scienze Biologiche Corso di Laurea di Primo Livello in Scienze Biologiche “Chemiotassi verso sostanze aromatiche tossiche in batteri utili per processi di biorisanamento ambientale” TESI di LAUREA Relatori Prof.ssa Elisabetta Zennaro Dott.ssa Livia Leoni Laureando Stefano Catarci ANNO ACCADEMICO 2004-2005

2. La chemiotassi batterica • Si definisce chemiotassi il movimento di avvicinamento di un organismo verso una sostanza chimica definita attraente (chemiotassi positiva) o il movimento di allontanamento da una sostanza chimica definita repellente (chemiotassi negativa) • Si distinguono due tipologie di motilità batterica: • Motilità flagello-dipendente • Motilità flagello-indipendente • Il movimento flagello-dipendente è caratterizzato dall’alternarsi di due azioni distinte: • l’avanzamento (movimento definito “running”) • il capovolgimento (movimento definito “tumbling”).

3. Schematizzazione del movimento batterico La chemiotassi batterica (da http://www.thewiper.com/cellula/)

4. I flagelli batterici sono eliche rigide la cui direzione di avvitamento sinistrorsa comporta: La loro unione in un fascio quando ruotano in senso antiorario, determinando l’avanzamento della cellula (“running”) La loro dispersione quando ruotano in senso orario, provocando il capovolgimento della cellula (“tumbling”) (da http://www.cfdrc.com/bizareas/biomedlife/comp_med/chemotaxis.html) La chemiotassi batterica

5. La chemiotassi batterica TRASDUZIONE DEL SEGNALE Il legame del repellente stimola l'autofosforilazione di CheA Molecola repellente Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi Rotazione antioraria del flagello (running)

6. La chemiotassi batterica TRASDUZIONE DEL SEGNALE CheA-P trasferisce il gruppo fosfato su uno specifico residuo di aspartato di CheY Molecola repellente Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi Rotazione antioraria del flagello (running) Regolatore di risposta associato a CheA

7. La chemiotassi batterica TRASDUZIONE DEL SEGNALE CheY-P interagisce con FliM determinando l'inversione di rotazione flagellare Molecola repellente Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi Rotazione oraria del flagello (tumbling) Regolatore di risposta associato a CheA Proteina FliM (interruttore del motore flagellare)

8. La chemiotassi batterica TRASDUZIONE DEL SEGNALE CheZ è responsabile della defosforilazione di CheY Molecola repellente Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi Rotazione antioraria del flagello (running) Regolatore di risposta associato a CheA Fosfatasi

9. La chemiotassi batterica TRASDUZIONE DEL SEGNALE Legame dell’ attraente con il chemiorecettore Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi Rotazione antioraria del flagello (running) Proteina FliM (interruttore del motore flagellare)

10. La chemiotassi batterica CheR metila costantemente il dominio citoplasmatico delle MCPs Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi ADATTAMENTO SENSORIALE Proteina FliM (interruttore del motore flagellare) Metilesterasi Metiltransferasi

11. La chemiotassi batterica La sovrametilazione di MCP determina l’autofosforilazione di CheA Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi ADATTAMENTO SENSORIALE Proteina FliM (interruttore del motore flagellare) Metilesterasi Metiltransferasi

12. La chemiotassi batterica CheA-P esibisce attività chinasica anche verso la proteina CheB Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi ADATTAMENTO SENSORIALE Proteina FliM (interruttore del motore flagellare) Metilesterasi Metiltransferasi

13. La chemiotassi batterica CheB-P demetila il dominio citoplasmatico delle MCPs Methyl-accepting Chemotaxis Protein Istidin chinasi ADATTAMENTO SENSORIALE Proteina FliM (interruttore del motore flagellare) Metilesterasi Metiltransferasi

14. La chemiotassi e la bioremediation Numerose evidenze sperimentali indicano che i batteri biodegradatori sono chemiotatticamente attratti verso inquinanti ambientali.

16. In una prima fase di questo studio sono state esaminate le risposte chemiotattiche verso il toluene di 5 specie batteriche in grado di degradarlo: Pseudomonas putida F1 (PpF1), Pseudomonas putida PaW15 Burkholderia cepacia G4 Ralstonia pickettii PKO1 Pseudomonas mendocina KR1 Ognuna di queste cinque specie presenta diverse reazioni iniziali delle vie per il catabolismo del toluene. La chemiotassi verso il toluene in Pseudomonas putida F1 (da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

17. La risposta chemiotattica al toluene di questi cinque ceppi è stata studiata con il metodo dell’ ”AGAROSE PLUG ASSAY”. (I ceppi sono stati coltivati in presenza di toluene) - P. putida F1, R. pickettii PKO1 e B. cepacia G4 mostrano una chiara risposta chemiotattica al toluene - Una debole risposta è stata osservata in P. putida PaW15 - Nessuna risposta verso il toluene è stata invece osservata in P. mendocina KR1 La chemiotassi verso il toluene in Pseudomonas putida F1 ( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

18. La chemiotassi verso il toluene in Pseudomonas putida F1 ( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000) Conclusioni: - Non tutti i ceppi che degradano il toluene presentano una risposta chemiotattica verso questo composto - Solo le cellule cresciute in presenza di toluene mostrano una risposta chemiotattica verso questo composto

19. Risposta chemiotattica di P. putida F1 verso il toluene in funzione del tempo (ingrandimento 40X) (P. putida F1 è stato coltivato in presenza di toluene.) Nessuna risposta è stata osservata quando il capillare conteneva solo agarosio e il tampone chemiotattico. La chemiotassi verso il toluene in Pseudomonas putida F1 “CAPILLARY ASSAY” (da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

20. Conclusioni: - P. putida F1 è attratto verso un determinato intervallo di concentrazione del toluene La chemiotassi verso il toluene in Pseudomonas putida F1 “CAPILLARY ASSAY” (da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

21. Risposta chemiotattica di P. putida F1, cresciuto in presenza di toluene, verso: - Benzene - Etilbenzene - Propilbenzene - ααα-trifluorotoluene (TFT) - tricloroetilene (TCE) - cis-1,2-dicloroetilene (DCE) - percloro etilene (PCE) La chemiotassi verso il toluene in Pseudomonas putida F1 “PLUG ASSAY” (da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

22. Il benzene, l'etilbenzene e il TFT sono degradati da PpF1 I composti alifatici alogenati quali il TCE, il DCE e il PCE sono biotrasformati da PpF1 La chemiotassi verso il toluene in Pseudomonas putida F1 “PLUG ASSAY” (da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

23. È stata analizzata la risposta chemiotattica al toluene di alcuni mutanti nei geni tod di Pseudomonas Putida F1. PpF4 PpF106 (mutanti in geni catabolici) PpF39/D F1todT::Km (mutante nel sistema regolativo) F1todR::Km (doppio mutante nei geni todR e todX)ΔtodX F1todX::Km (mutante nel gene per il trasporto del toluene) Ruolo dei geni tod nella chemiotassi di Pseudomonas putida F1 ( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

24. Conclusioni: - i mutanti catabolici dimostrano come la risposta chemiotattica verso il toluene sia dipendente dal riconoscimento diretto della molecola stessa e non di un suo intermedio catabolico - la proteina di membrana implicata nel trasporto del toluene TodX non è necessaria per la risposta chemiotattica verso il toluene - i mutanti regolativi dimostrano come i geni richiesti per la risposta chemiotattica al toluene siano controllati coordinatamente ai geni per la degradazione del toluene da TodS e TodT in presenza di toluene Ruolo dei geni tod nella chemiotassi di Pseudomonas putida F1 ( da Parales R.E., Ditty J.L. e Harwood C.S., 2000)

25. - La chemiotassi verso il toluene è indotta dalla crescita in presenza di toluene - La chemiotassi verso sostanze non utilizzate come fonte di carbonio (caso del TCE) è probabilmente la conseguenza di un bassa specificità di substrato del chemiorecettore del toluene - L'analisi dei mutanti regolativi suggerisce l’esistenza di una comunicazione incrociata tra il processo che regola la chemiotassi e quello che regola l’espressione dei geni catabolici, entrambi basati su analoghi meccanismi di fosfotrasferimento - La chemiotassi verso sostanze inquinanti potrebbe ricoprire un ruolo determinante nella scelta di ceppi batterici utili per scopi di biorisanamento Conclusioni