Laboratoire de Microbiologie Centre Hospitalier & Universitaire Saint Louis –Paris

1. Laboratoire associé au Centre National de Référence du VIH PROGRAMA FRANCO-BRASILEIRO DE AIDSFortaleza – CE, 22 a 24 de Novembro de 2006.Genotipagem HIV & Resistência Laboratoire de Microbiologie Centre Hospitalier & Universitaire Saint Louis –Paris francois.simon@sls.aphp.fr

2. Estudos de genotipagem visando os marcadores de progressão de resistência ou da progressão da aids Marcadores de progressão relacionados • com a diversidade do HIV • avaliação da replicação : cargas virais e reservatorio • Resistência : testes, algorithmo e consequencia

3. HIV = HIV-1 : 3 groupos , - 11 sob-typos HIV-2 : 7 groups Mangabey HIV-2 Chimpanzee HIV-1 Major M HIV-1 N HIV-1 group O Gorilla

4. Diversidade Genetica dos HIV - HIV-1  groupo Major • CRFs (Circulating Recombinant Form) • CRF01_AE = antigo sous-type E (Asia) • CRF02_AG = IbNg-like (Africa do l’oeste, Franca, Portugal, Brasil • CRF03_AB, CRF04_cpx … - groupos N (non-M/non-O) et O (outlier) : algumas cepas altement divergentes (Africa central ) • HIV -2 : 7 groupos A-G • (Africa lusofone)

5. Laboratoire associé au Centre National de Référence du VIH Diversidade molecular dos HIV na Franca - 2005 non-B em Franca < 1996 : 10 % > 1996 : 21 % > 2006 : 50% subtipo B : ainda predominante homo/bisexual subtiponon -B : 87% contaminaçãohétérosexual, CRF02 +++ ü3% dos novos casos = HIV-2 : Resistência natural no INRNT, T20 menor sensibilidade nos IP = HIV-O : Resistêncianatural no INRNT

6. Sub-tipo non B do HIV-1 Origine geografica dos pacientes CNR du VIH et InVS, données du 31/03/05 2003-1 2003-2 2004-1 2004-2

7. Diversídade molecular dos HIV na Franca Transmissão de cepas HIV-1 – resistênte ao TARV -- VIH-1 323 pacientes primo- infecção ANRS 2005 • HIV-1 subtipo B = 12.3%. • HIV-1 non B = 9.4 % • ITRN 6% • ITRNN 6% • IPs 3%

8. Diversídade molecular dos HIV no Brasil e consequencias • Casseb et al 98, USP 108 HIV-1 B : two major V3 motifs, GPGR and GWGR = B brasielero • Artur Ramos et UFRJ Al EID F + B, F + D, B + D • Bongertz et al 2000, Brazilian Network HIV characterization. B (in 83 % of the samples), F (14 %), and C (3%) • Couto-Fernandes JC 2006 : B, F, D, CRF02 , C

9.    Declínio da carga viral HIV e contagem CD4 • O depletion CD4 no HIV crônico é -- Comoum grupo -- na maior parte attribuable ao efeito direto do replication do HIV Mellors et AL, Science 1996

10.   Declínio da carga viral HIV e contagem CD4 Rodriguez et al. JAMA . Sept 27, 2006 • - 1512 pts US cohorts ao menos 6 meses • taxa da perda CD4 predisse por níveis do RNA de plasma HIV • diminuições medianas dos CD4 entre participants com vários níveis do RNA : • - 501 to 2000 copies/mL 39 cells/mm3;- 10,001 to 40,000 copies/mL : 56 cells/mm3;- > 40,000 copies/mL 78 cells/mm3

11.    Declínio da carga viral HIV e contagem CD4 • Carga viral refletiu por níveis do plasma não é a determinante principal da cinetica do declino dos CD4 no nível individual • Carga viral elevada e SIV non pathogenic • HIV-2: carga viral baixos e AIDS Rodriguez et al. JAMA . Sept 27, 2006

12. Declínio da carga viral ARN e ADN HIV e contagem CD4 (C. Rouzioux et Al 2005) % de AIDS a 5 anos

13. Carga Viral e diversidade HIV • - PCR sujeito aos riscos da diversidade dos VIH • - A utilização de sondas bem escolhidas reduz o problema • - Necessidade de vigilância +++ • Importância de harmonizar os testes • Expressão em UI

14. Carga viral e REAL TIME PCR Comparação Abbott e TaqMan Roche Mediane das differences em Log Sub –tipo B N=7 Sub –tipoA-CRF01 N=16 CRF02 N=49 CRF Outros N=16 Abbott Real time – Monitor -0.005 -0.06 0.25 0.05 Monitor –TaqMan Roche 0.15 0.17 0.24 0.33 Abbott – TaqMan Roche 0.2 0.4 0.57 0.41

15. Carga viral HIV e Resistência A monitoração viral da carga fica fondamental pele evaluaçao da resposta no TARV • O melhor marcador para o emergence de cepas HIV-1 – resistênte ao TART

16. HIV † † † Virus do Plasma 1,000,000 100,000 10,000 Ongoing Limite de deteccçao (50 copias/ mL) 1000 100 Plasma HIV-1 RNA (copias/mL) 10 reservatório viral 1 0.1 0.01 0.001 Tempo (anno)

17. Impacto do tratamento no reservatório viral latente Inicio TARV Stop TARV 100,000 Limit of detection 1000 Plasma HIV-1 RNA (copies/mL) 10 Release from stable reservoirs 0.1 0.001 0 1 2 3

18. Pressões seletivas da terapia Drug-susceptible quasispecies Drug-resistant quasispecies Tratamento Seleccçao dos quasispecies Drogas inadequadas Potencia inadequada Supressão Incomplete Resistência pre- TARV Adherence inadequate Viral load Time

19. Selecção de mutantes resistentes • Barreira genética baixa Mutação isolada Selecção rápida de mutantes ITRNN, 3TC • Barreira genética elevada Várias mutações podem ser necessárias para provocar uma resistência Classe da IP

20. Resistência : Testes in vitro • Genotypagem • detectar os Mutaçãoes conhecidos • Phenotypagem • Abilidade de um vírus selvagem ou recombinant para crescer em concentrações diferentes de ARV • “Virtual” phenotypagem • Uso de resultados do genotype para predizer o susceptibilidade phenotypica com uma base de dados - genotypos e phenotypos

21. Vantagens e desvantagens do genotype Desvantagens • Medida indireta, • incapaz de detectar os variants minor • padrões complexos do Mutaçãoal podem ser difíceis de interpretar Vantagens • rápido • « barato « • sensível para detectar misturas resistente • Tipagem do vírus

22. Vantagens e desvantagens do Phenotype Vantagens • medida quantitative da resistência • pode ser aplicada a todo o agente antiretroviral, including as drogas novas • pode avaliar interações entre os Mutaçãoes • exatos com subtypes, type, groupo HIV Desvantagens • cutoff não definidas para alguns agentes • Carissimo

23. Susceptibility Phenotypic: Relacionamento entre a concentração da droga e a inibição viral 100 Wild-type Resistant 50 Inibição do replication do vírus (%) resistance 0 Wild-type IC50 Resistant IC50 Concentração Da Droga

24. Vantagens e desvantagens do “Virtual” Phenotype Testing Desvantagens • Confiabilidade dependerá da exatidão do genotype • Valor da ligaçao genotype e dados phenotypicos ?? • Mais caro Vantagens • Poderai dar uma visão da atividade parcial das droguas

25. consequencias da resistencia do HIV / TARV : • 679 pacientes • - Resistência genotypic a qualquer classe de drogas antiretroviral observados em 53 assuntos (8%).  - Emergence de resistência associado com o mortalidade aumentado e mais elevadas com a resistência de NNRTI • (HR 1.75; 95% CI 1.27-2.43) British Columbia Centre for HIV & San Francisco General Hospital

26. Randomized Controlled Trials Estudos Positivos Estudos Negativos/Equivocal • GART • Genotype + expert advice (EA) vs standard of care (SOC) • Viradapt • Genotype vs SOC • Havana • Genotype vs EA vs genotype + EA vs SOC • VIRA 3001 • Phenotype vs SOC • RealVirfen • VirtualPhenotype vs phenotype • ARGENTA • Genotype vs SOC; benefit at 12 weeks lost at 6 months; outcome related to adherence • NARVAL • Genotype or phenotype vs SOC; no difference at 12 weeks; highly experienced pts • CCTG 575 • Phenotype vs SOC; no benefit at 6 or 12 months due to excellent performance of SOC • CERT • Phenotype vs genotype vs SOC

27. 2.0 1.0 0.0 -1.0 -2.0 -3.0 -4.0 N = 3 4 7 8 21 7 3 0 1 2 3 4 5 6 Resposta a APV de acordo com o número dos Mutaçãoes(in Narval trial ) Mude no RNA do plasma HIV-1 (Log copies/ml)) Número dos Mutaçãoes entre um set de 9 Mutaçãoes: L10I, V32I, M46I/L, I47V, I54V/L/M, G73S, V82A/F/T/I, I84V, L90M

28. CCTG 575 : Phenotype vs SOC • 238 pacientes com IP, estável para > 6 meses No mês 6, a redução no RNA do HIV era 0.71 e 0.69 log10 copies/ml para PHENO e SOC A proporção com < 400 copias/ml (48%) era a mesma para ambos os grupos. Nenhuma diferença foi vista no mês 12

29. HAVANA Trial resuldados:Pacientes com RNA HIV<400 c/ml na semana24 (ITT) Genotype sem Genotype Expert 69 % 49 % 59 % p = 0.002 sem Expert 46 % 36 % 41 % 58% 42% p = 0.02 Tural, 4th ICAAC 2000,

30. Without baseline Mutação With baseline Mutação Impacto da resistência da linha de base no resultado do tratamento: Estudo do FTC Naive pts, baseline VL > 5000 copies/mL Incidence of Virologic Failure (%) Any NNRTI NRTI K103N Any NNRTI NRTI K103N Mutação type: FTC + ddI + EFV n = 270 d4T + ddI + EFV n = 276 Borroto-Esoda K, et al. CROI 2004. Abstract 672.

31. Resposta no Tipranavir na semana 24 de acordo com o gene Mutaçãoes do protease Percentage of patients   P= 0.0015 0.0119 <0.0001 <0.0001

32. Algoritmos da interpretação da resistência genotypic HIV-1 O grupo da resistência AC11 de ANRS fornece algoritmos da interpretação genotypic da resistência das drogas anti- HIV-1(« REDAGENFrances ») • Algoritmos baseados na correlação entre Mutaçãoes da resistência da droga e o resultado virological • atualizadas regularmente http://www.hivfrenchresistance.org/

33. NUCLEOSIDE AND NUCLEOTIDE REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS ANRS 2006

34. Padrões da resistência após a falha initial do ITRN 41, 67, 7O, 210, 215, 219 K70E

35. TAMs : Dichotomous resistências ZDV ou d4T TAMs emerge sequencialmente com regimens de ZDV- e de d4T-containing após M184V 6 identified: M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, K219Q/E/N/R Fatores desconhecidos 41L 210W 215Y 67N 70R 219Q Resistência mais alta ZDV ZDV resistanceNível mais baixo

36. TAMs : Dichotomous resistências 41-210-215 • resistência dos níveis mais elevados • mais resistente ao outro NRTIs, including o tenofovir, • menos sensitized/M184V • Hypersusceptibilidade ao ITRNN 67-70-219 - resistência dos níveis mais baixos • menos cruz-resistente ao outro NRTIs • mais sensitized/M184V

37. O « caso » M184V • M184V emerge ràpidamente nos regimens nonsuppressive que contêm 3TC ou FTC • mas também a redução na capacidade do replication • Aumenta a sensibilidade na ZDV, no d4T, no TDF; diminuições no ABC e ddI,

38. Abacavir & M184V, L74V, K65R • ABV - M184V, L74V, e K65R se nenhum analogue do thymidine estiver no regimen - M184V e TAMs na presença de um analogue do thymidine

39. NON-NUCLEOSIDE REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS ANRS 2006 EFV: efavirenz, NVP: nevirapine, ETV (TMC125): etravirineMutaçãoes com o signification incerto: K101H/N/P/Q

40. Resistência no NNRTI = Reduz Marcada A Resposta Do Tratamento No B/L NNRTI resistance B/L NNRTI resistance 84 90 73 80 70 60 50 % VL < 400 c/mL at Wk 48 40 30 20 9 9 10 0 TDF/FTC + EFV ZDV/3TC + EFV Gallant JE, et al. N Engl J Med. 2006;354:251-260.

41. NNRTIs: Mutaçãoes Importantes • O mais comum: K103N, Y181C • Estes conduzem também à resistência de NNRTI: L100I, V106A, V108I, Y188L, G190A/S, P225H • Outras substituições nos loci pertos podem induzir a resistência de NNRTI

42. Conseqüências clínicas da resistência à NNRTIs • cruz-resistência extensiva de NNRTI entre drogas • nenhum impairment da capacidade do replication • Nevirapine quando o zidovudine ou o stavudine estão no regimen, o Mutação de K103N é selecionado preferivelmente • Subtipo C : V106M ++

43. PROTEASE INHIBITORS ANRS 2006

44. Vista geral da resistência do PI Mutaçãoes do PI podem ser limitada sem resistência transversal • NFV: D30N (L90M non subtipo B) • ATV: I50L • FPV: I50V (reduz o susceptibility o LPV) • Resposta to ritonavir-boosted PI (LPV/r, FPV/r, SQV/r)

45. Vista geral da resistência do PI • Major PI Mutaçãoes: M46I/L, V82A/F/T/S, I84V/A/C, L90M afetarão todo o PIs atual • Minor PI Mutaçãoes: L10F/I/R/V, V32I, I54V/M/L Número crescente = resistência crescente, Em caso de grande número mutaçãoes PI phenotyping poderia ajudar ??

46. FUSION INHIBITOR ANRS 2006 • T20 • G36A/D/E/S/V V38A/E/K/M Q40H/K/P/T N42D N43D/H/K/S N42T + N43S L44M L45Q/M Resposta individual altamente variavel Complexidade da interpretaçao do genotipe

47. Dosagens plasmaticos dos ARV quociente inhibiteur • Ratio Cmin / CI50 ou CI90 • Cmin : concentration résidual plasma do IP • CI50-CI90 de l’IP : teste phénotypico réal ou virtual quocienteInhibiteur Génotypique (GIQ) • Ratio Cmin de l’IP / numero de mutaçãoes • critèrios • Génotypiques de resistência • Pharmacocinétique • Posologie individualizado • Valor preventivo sobre resposta virulógica ??

48. 10 1 0.1 0 2 4 6 8 10 12 0.01 Relacionamento do quociente inhibitory à resistência da droga Ctrough Smaller IQ for mutant CI50 (mutant HIV) Drug concentration (mg/mL) IQ (wild-type HIV) CI50 (wild-type HIV) Time after dosing (hours)

49. HIV- 2resistência genotypic ANRS 2006 • NRTI Q151M : resistência d4T, ABC Q151M + M184V : resistência NRTI except TDF M184V : resistência 3TC/FTC NNRTI Naturalmente resistência natural a tudos os a NNRTI [3, 4] PROTEASE INHIBITORS resistência a APV e aos dados contradictory do fosAPV e para ATV • FUSION INHIBITOR Naturalmente resistente a T20 [3, 4]

50. Limitações dos testes da resistência • Falta de controles de qualidade uniformes através dos laboratórios diferentes • O custo elevado • Não pode ser executado com o RNA < 1000 copies • Não pode poder detectar populações do vírus resistente < 20% • reservatórios viral também não detectados