Vera Luiza Capelozzi Departamento de Patologia

1. PATOLOGIA O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico Vera Luiza Capelozzi Departamento de Patologia Faculdade de Medicina - Universidade de São Paulo – Brazil e-mail: vcapelozzi@lim05.fm.usp.br

2. Imunofluorescência • Técnica precursora IHQ: reações antígeno-anticorpo • Tecido fresco congelado, microscópio especial, pobre definição morfológica • Anos 80-90: IHQ aplicação ampla na Patologia Cirúrgica • Detecção mais sensível: Acs monoclonais altamente específicos, idênticos e em abundância • Cortes inicialmente congelados: fixação em formalina e embebição em parafina

3. IHQ: Tipos de Anticorpos • Monoclonais e policlonais • monoclonais: mais específicos • policlonais: reconhecem diversos epítopos • injeção de um antígeno peptídico em animais • após a estimulação de resposta imune secundária • isolamento dos anticorpos a partir do soro • Primários e secundários • primários: antígeno de interesse e são não-marcados • anticorpos secundários • produzidos contra anticorpos primários • reconhecem IGs de uma espécie particular e • são conjugados : biotina , fosfatase alcalina , peroxidase , Flúor Alexa ou Fluor DyLight

4. IHQ: Preparação das Amostras Cortes: finos 4μm , micrótomo lâminas Controles padronização processamento e fixação “Controles internos”: tecido (ou células) da mesma secção secção do mesmo espécime da paciente “Controles externos”: tecidos (ou linhas de células) de outras fontes células negativas e outras positivas de expressão do antígeno em questão

5. IHQ: Direta e Indireta • Direto (one-step) • anticorpo marcado (e.g. Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) conjugado • reage diretamente com o antígeno no tecido • simples e rápido • baixa sensibilidade: pequena amplificação de sinal

6. Ac primário não-marcado (primeira camada) • + Ag do tecido • + Ac secundário marcado (segunda camada) • contra IgG da espécie animal na qual Ac primário foi produzido • segunda camada Ac marcada com corante fluorescente ou enzima • Método mais sensível: • amplificação maior: reações Ac secundários com diferentes sítios antigênicos do Ac primário • Número pequeno de Ac secundários conjugados (marcados) gerado • Ex: Ac secundário marcado produzido contra IgG de coelho (comprado sem encomenda) reage com qualquer Ac primário produzido em coelhos • Método direto: • produzir Acs marcados customizados contra cada antígeno de interesse

7. HE & IHQ

8. IHQ: Indicações na Patologia Cirúrgica • tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada • órgão de origem de uma neoplasia diferenciada • subtipagem de neoplasias (linfomas) • fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos (por exemplo, hormônios) • identificação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células • detecção de células neoplásicas metastáticas • diferenciação proliferação celular maligna e benigna

9. IHQ: Marcadores diagnósticos • técnica excelente de detecção: local exato da proteína no tecido • maior desvantagem • ao contrário do immunoblotting: coloração checada contra um peso molecular • impossível mostrar que a coloração corresponde à proteína de interesse • Acs primários devem validados por Western Blot

10. Pan Citoqueratina: celulares epiteliais e todos carcinomas; alguns sarcomas • CD45 (LCA): marcador de leucócitos; • HMB45: marcador de melanoma e nevos azul, de Spitz e juncional, angiomiolipoma; • S100: células gliais e de Schwann, melanócitos, células de Langerhans e células reticulares interdigitantes • Vimentina: marcador de células de origem mesenquimal (sarcomas); • Actina: leiomiossarcoma (positivo), câncer papilar de mama (negativo) e outros; • Alfafetoproteína(AFP): tumores de células germinativas (seio endodérmico) e carcinoma hepatocelular; • BCL-2: linfoma folicular x hiperplasia reacional, subtipos de linfomas, carcinomas e sarcomas; • CA 125: ovário, vesícula seminal, colo uterino, endométrio, trato gastrintestinal, tireóide e mama; • Antígeno prostático específico (PSA): para câncer de próstata; • Receptores de estrogênio e progesterona: marcadores prognósticos em câncer de mama; • CD3 (Pan-T): linfomas de células T; • CK7: epitélios glandulares e transicional - subtipos de carcinomas, ductos biliares; • CD10 : células foliculares e linfoblastos, normais e neoplásicas, estroma endometrial e células renais; • CD15: granulócitos maduros, células de Hodgkin e de Reed-Sternberg e diversos adenocarcinomas • CD20 (Pan-B): linfomas de células B; • CD30 (Ki-1): linfoma de Hodgkin, linfoma de grandes células anaplásico e carcinoma embrionário; • CD117 (proto-oncogene c-KIT): estroma gastrointestinal (GIST), carcinomas e leucemias, mastócitos; • CK20: tumores gastrointestinais, carcinoma de células transicionais, tumor de células de Merkel; • Cromogranina A: diferenciação neuroendócrina; • Desmina: células musculares, estriadas ou lisas - tumores musculares lisos e estriados • E-caderina: carcinoma ductal x carcinoma lobular de mama • Erb-B2/Her-neu: mama, ovário e trato-gastrointestinal. Prognóstico e preditivo em carcinoma de mama; • KI-67: marcador de proliferação celular; • Proteína P53: produto do gene supressor tumoral marcador prognóstico • TTF-1: marcador de carcinomas de pulmão e tireóide e neoplasias neuroendócrinas.

11. CK-7 Caspase-9 TTF1 CD56 Bcl-2 MMP-9 AE1+AE3 CD1a P63 Vimentina IL-4 CD3 CD68

12. Câncer de Pulmão: Tipos Histológicos Classificação WHO 2004 – Tipos Maiores1 *Inclui CA adenoescamoso, CA sarcomatoides, Carcinoides, CA glândulas salivares, e Carcinomas inclassificáveis Outros*24.0% Adenocarcinoma 38.3% LCC 5.0% SCLC 13.0% 19.7% SqCC Percentual distribuido entre casos classificaveis, 2001-20042 1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.

13. Carcinoma Não-PequenasCélulas (NSCLC): TiposHistológicos Adenocarcinoma Carc Cels Escamosas 19% Carc Grandes Células 38% Não Especificado (NOS) 14% 29% 1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.

14. NSLCL: 70% Apresentação como Doença Avançada

16. Análise molecular de adenocarcinomas Sem mutação KRAS22% AKT1 EGFR17% NRAS MEK1 EML4-AKL7% MET AMP HER2 PIK3CA 2% BRAF 2% DoubleMutants 3% • Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) • Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01

17. Alvos moleculares potencialmente “tratáveis” Alvos emergentes “tratáveis” em CA Celulas Escamosas de pulmão Alvos emergentes “tratáveis” em Adenocarcinoma de pulmão K-rasEGFRB-rafHER2PIK3CAALKMETOther Outro (Indeterminado) Bang Y, et al. ASCO 2010. Abstract 3. Hammerman P, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract PRS.1

18. IHQ: Marcadores Diagnósticos Adenocarcinoma Carc Cels Escamosas TTF1 p63 Travis WD; USCAP 2012

19. IHQ, FISH, PCR: Marcadores Preditivos e Diagnósticos Gene copy number by FISH for epidermal growth factor receptor Mutation in epidermal growth factor receptor Protein expression by immuno-histochemistry for epidermal growth factor receptor Qual Material? Huber Herbst RS, Hirsch FR. Lancet 373 (2009)

20. Patologia Cirúrgica: Rotina • O que o Tipo de Procedimento na Obtenção da Biópsia pode Oferecer? • - biópsia por agulha em múltiplos pontos ou “core” biópsia mínima : como definir histologia e análise molecular? • - fatores que influenciam as análises moleculares • Como Atender ao que o Patologista pode fazer? • Como Facilitar o que quer saber o Oncologista?

21. Kevin L, USCAP 2012

22. Kevin L, USCAP 2012

23. Optimizando o Diagnóstico em Biópsias Pequenas

24. Histologia: • grupo de células incluso maligno • “não pequenas” células • não favorece adenocarcinoma pela morfologia Recomendável IHC para confirmar origem pulmonar • Resultados: • TTF1 neg, CK7 pos • Tumor insuficiente recortes: Napsin A, CK20, sinaptofisina, cromogranina, e P40... • Laudo: • “carcinoma não pequenas células, NOS”, • clínico pergunta: tumor de uma paciente com antecedentes de câncer de mama... • ... se for, recomendável pesquisa de Her2neu

25. Se pensarmos: • mais a favor de adenocarcinoma • precisamos saber se trata de AIS • Se não: • como temos certeza da ausência de diferenciação escamosa • recomendamos pesquisa de EGFR e ALK

26. Mudanças na Histologia do Câncer de Pulmão • Pequenas Células (SCLC) • 15% de todo câncer de pulmão • incidência em declínio • Não-Pequenas Células (NSCLC) • 80% de todo câncer de pulmão • tipos de NSCLC : • células escamosas • adenocarcinoma • grandes células

27. Carcinoma não-pequenas células • Adenocarcinoma • - padrão glandular • mucina positiva (50%) • CK7+/CK20- • TTF1+ Napsin A • Carcinoma células escamosas • queratinização celular • pontes intercelulares • escamas córneas • CK7-/CK20- • P63+ CK5/6+ WHO Comum, mas não 100% WHO Comum, mas não 100%

29. NSCLC – NOS – MICROSCOPIA ÓPTICA

30. NSCLC – FAVORECE ADENOCARCINOMA TTF1 TTF1

31. NSCLC- FAVORECE ADENOCARCINOMA CONFIRMADO PELA MOLECULAR Travis W, USCAP 2012

32. NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA Travis W, USCAP 2012

33. NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA

34. NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA- BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA Travis W, USCAP 2012

35. MUTAÇÃO EGFR – ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE SINALIZAÇÃO Travis W, USCAP 2012

36. EGFR – EXON 21 – L858R- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010

37. EGFR – EXON 19 – DELEÇÃO- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010

38. Análise molecular de adenocarcinomas Sem mutação KRAS22% AKT1 EGFR17% NRAS MEK1 EML4-AKL7% MET AMP HER2 PIK3CA 2% BRAF 2% DoubleMutants 3% • Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) • Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01

39. Quantificação da Expressão do EGFR FLEX Alta EGFR IHC score ≥200 N=345; 31% Baixa EGFR IHC score <200 N=776; 69% IHC score=112 IHC score=0* IHC score=270 Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão Huber Pirker, WCLC 2011, Abst O01.06 *This field

40. EGFR-Anticorpo – FLEX Maintenance NSCLCwet IIIB/IV EGFR- expressing Chemotherapy + Cetuximab Cetuximab until PD or intolerable toxicity Chemotherapy Pirker R et al. J Clin Oncol 2008, 18S (abstract 3), Lancet 2009;373: 1525–31 Huber Huber

41. FLEX: sobrevida No effect of kRAS-Mutation and EGFR-FISHO'Byrne P ea. ASCO 2009 CT, chemotherapy; HR, hazard ratio; OS, overall survival Pirker R ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: 1525–31 Huber Huber

42. Sobrevida com Alta Expressão EGFR (N=345) 100 90 80 70 60 50 Overall survival (%) 40 30 20 10 0 0 6 12 18 24 30 Months Number of patients at risk Number of patients at risk Number of patients at risk CT CT 167 167 108 108 58 58 36 36 11 11 0 0 CT + cetuximab CT + cetuximab CT + cetuximab 178 178 178 128 128 128 86 86 86 61 61 61 24 24 24 0 0 0 Huber *When adjusted for prognostic factors: HR 0.67 [95% CI 0.52–0.87], p=0.002; †Logrank

43. CONCLUSÃO Medicina Personalizada do Paciente Câncer de Pulmão Avançado deve ser Direcionada para Histologia e Genética (IHQ, ISH, PCR) OBRIGADA!!