Mutazioni nei geni strutturali ii il connettivo
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MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo PowerPoint PPT Presentation


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MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo. Lezione 5. Osteogenesi Imperfetta (OI). FACIES:. Estrema fragilita’ delle ossa Ipomineralizzazione Fraquenti fratture congenite

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MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo

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Presentation Transcript


Mutazioni nei geni strutturali ii il connettivo

MUTAZIONI NEI GENI STRUTTURALI II: il connettivo

Lezione 5

By NA


Osteogenesi imperfetta oi

Osteogenesi Imperfetta (OI)

FACIES:

  • Estrema fragilita’ delle ossa

  • Ipomineralizzazione

  • Fraquenti fratture congenite

  • Sclere bluastre o blu-grigio(l’OI e’ una patologia del tessuto connettivo e, quindi puo’ coinvelgere tessuti diversi da quello osseo)

  • (n.b la sclera e’ la parte non trasparente della tunica esterna dell’occhio)

  • Crescita anomala del cranio e tardiva chiusura della fontanella anteriore(dopo il primo anno di vita)

  • Sviluppo intellettivo normale

  • Dentinogenesi imperfetta

  • AUTOSOMICA DOMINANTE

1/10.000 IN TUTTO IL MONDO

By NA


Classificazione clinica

Classificazione clinica

Fratture durante l’infanzia, meno frequenti dopo la puberta’. Statura normale , deformita’ minima. Sclere bluastre, denti normali. A volte perdita dell’udito

I

Gravi deformita’ e fratture ossee congenite. Di solito letale in eta’ perinatale per insufficienza respiratoria

II

Fratture congenite con progressivo rallentamento della crescita. Denti anormali, sclere bluastre, possibile perdita dell’udito

III

Fragilita’ delle ossa lieve o moderata, denti anormali, sclere normali o grigiastre, possibile perdita dell’udito

IV

By NA


Genetica dell oi

Genetica dell’OI

AFFETTI

AUTOSOMICA DOMINANTE

a

a

a

A

A

A

omozigote

Genotipo

eterozigote

omozigote

Fenotipo

Non affetto

By NA


Basi biochimiche dell oi

Basi biochimiche dell’OI

OTTIMO CANDIDATO

IL COLLAGENE E’ LA PROTEINA PIU’ ABBONDANTE DEL TESSUTO CONNETTIVO

VISTI GLI ASPETTI FENOTIPICI DEVE DIPENDERE DA UN DIFETTO DELLA STRUTTURA DEL TESSUTO CONNETTIVO

By NA


Il collagene

Il collagene

a2

a1

a1

Dominio a tripla elica

C-term

N-term

Esistono tipi diversi di collagene nei vari tessuti. Essi si differenziano per lunghezza, sequenza dei diversi domini, per composizione e dimensione dei peptidi C e N terminali e per proprieta’ fisiche.

Il collagene di Tipo I e’ piu’ abbondante in pelle, tendini, ossa e arterie. Questi sono anche i tessuti maggiomente interessati dalla OI

By NA


Sintesi del collagene

Sintesi del collagene

cfr.testo

By NA


Prove del coinvolgimento del collagene nell oi

Prove del coinvolgimento del collagene nell’OI

DIVERSA MIGRAZIONE DIVERSA PROTEINA

ISOLAMENTO DELLE PROTEINE

PELLET CELLULARE

MEZZO DI COLTURA

COLTURA IN PRESENZA DI 3H-PROLINA

PROa1(III)

Le proteine sono state tagliate e separate per elettroforesi evidenziando che un frammento del proa1(I) migrava in maniera anomala

PROa1(I)

SDS-PAGE

PROa2(I)

C’era una delezione nella proteina

C OI C OI

By NA


Clonaggio del gene di oi1

Clonaggio del gene di OI1

  • 1979 YAMAMOTO E CO.isolarono il cDNA del COA1

  • mRNA del collagene e’ stato estratto dal tessuto osseo di embrioni di pollo e frazionati in base alle dimensioni per centrifugazione su gradiente di saccarosio.

  • Le diverse frazioni sono state saggiate per la capacita’ di codificare il procollagene in un sistema acellulare per traduzione.

  • Dalle frazioni capaci di codificare il procollagene e’ stato costruito il cDNA.

  • Clonaggio del cDNA nel plasmide pBR322 e successiva trasformazione batterica in E.Coli

  • Trasferimento delle colonie su filtro e ibridazione con il cDNA marcato radiattivamente.

  • Isolamento colonie positive.

  • Verifica con saggio di legame al filtro:

  • Denaturazione del DNA del clone positivo.

  • Legame a colonna.

  • Caricamento della colonna con RNA estratto da ossa di pollo.

  • Allontanamento dell’RNA non legato ed Eluizione dell’RNA legato.

  • Test per la produzione di COA1 mediante traduzione in vitro.

By NA


I tipi di collagene

I tipi di collagene

TRAMITE SCREENING DI LIBRARY GENOMICHE E’ STATO POSSIBILE ISOLARE DIVERSI GENI PER IL COLLAGENE.

  • ESISTONO DIVERSE CLASSI DI COLLAGENE:

    COLLAGENI FIBRILLARI(DI TIPO I II III V E XI)

    COLLAGENI NON FIBRILLARI(i domini a tripla elica sono

    interrotti da domini non a tripla elica)

    COLLAGENI A CATENA BREVE (TIPO VII)

  • OGNI CATENA DEL COLLAGENE E’ CODIFICATA DA UN GENE DISTINTO. QUESTI GENI PRESENTANO OMOLOGIA DI SEQUENZA ELEVATA.

  • I GENI PER IL COLLAGENE FANNO PARTE DI UNA FAMIGLIA GENICA (insieme di geni con un elevato grado di omologia di sequenza e codificanti per prodotti con funzione simile o correlata. Possono contenere elemeni non funzionanti detti PSEUDOGENI)

By NA


Origine della famiglia del collagene

Origine della famiglia del collagene

diversificazione

mutazione

geneA

duplicazioni

duplicazioni

FAMIGLIA GENICA1

es.collagene fribrillare

FAMIGLIA GENICA2

es.collagene a catena breve

Tali geni si sarebbero originati in seguito a fenomeni di DUPLICAZIONE di un unico gene ancestrale e successiva diversificazione per effetto di mutazioni nelle diverse copie.

By NA


Mappatura dei geni del collagene

Mappatura dei geni del collagene

  • TECNICHE COME COSTRUZIONE DI IBRIDI SOMATICI E IBRIDAZIONE IN SITU HANNO PERMESSO DI MAPPARE QUESTI GENI.

SEBBENE DERIVINO DA UN GENE ANCESTRALE COMUNE I GENI PER IL COLLAGENE SONO DISPERSI NEL GENOMA, MAPPANO CIOE’ SU CROMOSOMI DIVERSI:

es. il gene per la catena a1(I)(COA1) e’ localizzato sul chr17, mentre esistono geni per altre catene del collagene sui cromosomi 2, 7, 12 etc.

E’ VERAMENTE UNA MUTAZIONE IN UNO DI QUESTI GENI A PROVOCARE L’OI????

By NA


Mutazioni nei geni strutturali ii il connettivo

Enzima

A

Enzima

B

B1

B2

A2

A3

A1

B1

B2

A3

A1

mutazione

elimina il sito

di restrizione

endonucleasi A

endonucleasi B

Pattern di ibridazione su

filtro

L’identificazione di mutazioni nel gene del collagene in casi di OI ha richiesto complesse analisi di linkage tramite polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione(RFLP)

  • RFLP: Variazione della sequenza nucleotidica che interessa il sito di riconoscimento di un enzima di restrizione

By NA


Studi di linkage

Studi di linkage

cDNA COL1A2

10.5Kb

3.5Kb

A2

A3

A1

GEL

Il cDNA di COL1A2 venne testato nella popolazione generale (normale) per individuare

la presenza diRFLP

EcoR1

cDNA COL1A2

14Kb

A1

A2

Se si digerisce il DNA genomico di individui normali che non mostrano la OI presi a caso nella popolazione e si ibrida con il cDNA di COL12A si nota che la regione omologa al cDNA e’ polimorfica: cioe’ nel DNA puo’ essere presente o meno un sito di restrizione. Questo si nota nella popolazione normale.

filtro ibridato con cDNA

By NA


Mutazioni nei geni strutturali ii il connettivo

14Kb

A1

A2

14Kb

A1

A2

3.5Kb

10.5Kb

A1

14Kb

A1

A2

A2

3.5Kb

10.5Kb

A1

A2

A3

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 2 frammenti di = lunghezzae’: 14 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione non e’ presente un altro sito QUINDI UNA SOLA BANDA

Omozigoti per allele

14:14/14

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 4 frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb perche’ su entrambi i cromosomi in quella regione e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA. QUINDI 2 BANDE

Omozigoti per

allele

10.5,3.5:

10.5,3.5/

10.5,3.5

In questo gruppo di individui il cDNA riconosce nel genoma dopo digestione 3 frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb originati dalla digestione di un cromosoma (perche’e’ presente un altro sito che cade all’interno della regione identificata dal cDNA) e 1 frammento da 14 originato dalla digestione dell’ altro cromosoma. QUINDI 3 BANDE

Eterozigoti per alleli

14 e10.5,3.5

14/10.5,3.5

3.5Kb

10.5Kb

A2

A3

A1

By NA


Famiglie oi1

Famiglie OI1

LA MUTAZIONE OI DEVE RISIEDERE INSIEME CON IL POLIMORFISMO, CIOE’ NEL GENE COL1A2

I

II

III

IV

1

2

-/- -/+

1

2 3 4 5 6

-/- -/+ -/- -/- -/+ -/-

1 2 3 4 5 6

-/- -/- -/+ -/+ -/+ -/+

1 2 3 4

-/- -/- +/+ -/+

Il polimorfismo non rappresenta la causa dell’OI, ma e’ inprobabile che tale variazione segreghi con il fenotipo OI per caso...

By NA


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