生物安全 Biosafety 动、植物用转基因微生物的安全性

1. 生物安全Biosafety动、植物用转基因微生物的安全性 红河学院生命科学与技术学院

2. 微生物的特点 • 个体小 • 繁殖快 • 数量大 • 易变异 • 分布广泛 • 生命力强 • 容易扩散

3. 内容提要 （1）动、植物用转基因微生物的发展概况； （2）动物用转基因微生物的安全性评价（受体微生物的安全性评价、转基因操作的安全性评价、动物用转基因微生物的安全性评价、动物用转基因微生物产品的安全性评价）； （3）植物用转基因微生物的安全性评价（受体微生物的安全性评价、转基因操作的安全性评价、植物用转基因微生物的安全性评价、植物用转基因微生物产品的安全性评价）； （4）动、植物用转基因微生物的安全管理（国外、国内）。

4. 动、植物用转基因微生物的定义 • 动物用转基因微生物主要包括动物用转基因活疫苗和动物用转基因活微生物饲料添加剂； • 植物用转基因微生物是指通过重组DNA技术研制的，直接应用于植物上具有杀虫、防病、固氮、调节生长等作用的微生物。

5. （一）转基因微生物概况 • 转基因动物用微生物的研究与开发起步于20世纪80年代初 • 口蹄疫病毒是最早研究的对象 • 国际上发达国家对基因工程疫苗的研究与开发十分重视 • 已相继研制成功一些用于动物疫病免疫预防用的基因工程亚单位疫苗、基因工程重组活载体疫苗、基因缺失疫苗、DNA疫苗等

6. 1.转基因微生物饲料添加剂 • 酶制剂 以基因工程研制能高效表达植酸酶的重组毕氏酵母。 • 抗菌肽 减少或完全替代抗生素药物。 • 重组生长激素

7. 2.基因工程亚单位疫苗 • 利用体外表达系统（如大肠杆菌，酵母，动物细胞，杆状病毒-昆虫细胞等） • 表达病毒的主要保护性抗原蛋白作为亚单位疫苗 • 不仅具有优良的安全性，而且便于规模化生产 • 利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然感染的动物

8. 涉及动物病原 • 大多数禽、猪、牛等动物的病原体 • 免疫原性蛋白（保护性抗原） • FMDV VP1、狂犬病病毒的囊膜蛋白G，AIV HA蛋白，伪狂犬病病毒的囊膜糖蛋白gP50，新城疫病毒F和HN蛋白, 传染性法氏囊病毒VP2蛋白，传染性胃肠炎病毒的纤突蛋白，鸡传染性贫血病病毒的衣壳蛋白（VP1）……….

9. 2.基因工程重组活载体疫苗 • 痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体 • 具有常规弱毒疫苗的所有优点 • 便于构建多价疫苗 • 利用非疫苗用基因或其表达产物可以建立鉴别诊断方法

10. 利用痘病毒作为载体 • 痘苗病毒 • 数十种病原的基因在痘苗病毒中进行了表达，都显示出不同程度的免疫保护性。比较成功的有表达狂犬病病毒G蛋白的重组痘苗病毒和表达牛瘟病毒F和HA蛋白的重组痘苗病毒疫苗 • 禽痘病毒（鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、鸽痘病毒 ）

11. 新城疫病毒F和HN蛋白 • 禽流感病毒的HA和NP蛋白 • 马立克氏病毒gB糖蛋白 • 禽白血病囊膜蛋白 • 传染性法氏囊病病毒VP2蛋白 • 禽网状内皮增生症病毒囊膜蛋白 • 火鸡出血性肠炎病毒Hexon蛋白

12. 利用腺病毒作为载体 • 目前已有许多外源基因被插入腺病毒并得到表达 • SIV • 水疱性口炎病毒 • 狂犬病病毒 • 牛副粘病毒3型 • 牛疱疹病毒I型 • 牛冠状病毒 • 猪传染性胃肠炎病毒

13. 利用疱疹病毒作为载体 • 火鸡疱疹病毒、伪狂犬病病毒、牛疱疹病毒I型和鸡传染性喉气管炎病毒 • 已完成动物试验并显示出良好前景的重组疱疹病毒疫苗： • 口蹄疫病毒VP1基因，猪瘟病毒E2基因，猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5基因，猪流感病毒HA基因的重组伪狂犬病毒疫苗 • 表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组马立克氏病毒疫苗 • 表达禽流感病毒HA基因的重组传染性喉气管炎病毒疫苗

14. 利用细菌作为载体 • 大肠杆菌 • 沙门氏菌 • 李氏杆菌 • 目前国际上基因工程疫苗研究与开发的热点之一

15. 3.基因缺失疫苗 • 一类发展前景很好的基因工程疫苗 • 伪狂犬病基因缺失疫苗(双基因和三基因缺失疫苗，如TK-/gG-、TK-/gE-、TK-/gC-和TK-/gE-/gI-等，并已商品化生产 • 牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）TK基因缺失疫苗

16. 4. DNA疫苗 • DNA疫苗可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫 • 已发现DNA接种对许多病毒、细菌、寄生虫感染以及肿瘤的预防均有一定的效果

17. 其他疫苗 • 可食性疫苗(利用转基因植物) • 多表位疫苗 • T细胞疫苗 • RNA复制子疫苗

18. 基因工程疫苗的产业化与应用是目前和今后的发展趋势基因工程疫苗的产业化与应用是目前和今后的发展趋势 • 含狂犬病毒gB基因的重组牛痘病毒疫苗，已在北美和欧洲广泛应用于预防野生动物的狂犬病 • TK和gE双基因缺失的伪狂犬病疫苗已在美国和大部分欧盟国家广泛应用于预防猪伪狂犬病和猪伪狂犬病根除计划 • TK和gE双基因缺失的牛传染性鼻气管炎病毒疫苗也在许多国家使用，荷兰于1998年5月在全国范围内推广使用TK和gE双基因缺失的疫苗以便根除此病 • 表达禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒疫苗和表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒疫苗也已获得美国农业部注册，开始产业化生产

19. 2、国内研发情况 • 我国动物用基因工程疫苗的研究与发达国家之间没有实质性差距，而且取得了巨大进展 • 十五期间，国家863计划在动物用基因工程疫苗与诊断试剂的研究与开发方面的投入有所加强 • 近几年，我国动物用基因工程疫苗研究呈现出加速发展的态势，已有多种基因工程疫苗已经问世，并进入安全性评价的不同阶段

20. 涉及的主要疫病 • 禽流感病毒 • 鸡新城疫病毒 • 禽传染性喉气管炎病毒 • 鸡传染性法氏囊病病毒 • 鸡马立克氏病病毒 • 猪伪狂犬病病毒 • 猪瘟病毒 • 口蹄疫病毒 • 猪繁殖与呼吸综合征病毒 • 猪圆环病毒2型 • 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 • 大肠杆菌 • 猪囊虫

21. 第一个商品化的疫苗——仔猪腹泻大肠杆菌K88/K99二价基因工程疫苗第一个商品化的疫苗——仔猪腹泻大肠杆菌K88/K99二价基因工程疫苗

22. 已通过农业转基因生物安全评价，并获得农业部新兽药证书，进入产业化生产和应用阶段的基因工程疫苗已通过农业转基因生物安全评价，并获得农业部新兽药证书，进入产业化生产和应用阶段的基因工程疫苗 • 禽流感重组灭活疫苗 • 禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗 • 传染性喉气管炎重组鸡痘病毒活载体疫苗 • 伪狂犬病基因缺失疫苗 • “O”型口蹄疫病毒基因工程疫苗 • 以新城疫病毒为载体的重组禽流感疫苗

23. 已通过农业部农业转基因生物安全评价的疫苗 • 猪生长抑素基因工程疫苗 • 马立克氏病基因工程活载体疫苗 • 猪囊虫核酸疫苗 • 幼畜腹泻双价基因工程苗 • 新城疫重组鸡痘病毒基因工程疫苗 • 动物去势疫苗

24. 进入安全性评价不同阶段的产品越来越多，数量不断上升进入安全性评价不同阶段的产品越来越多，数量不断上升 • 各类动物疫病的基因工程亚单位疫苗 • 以禽痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒为载体的基因工程重组活载体疫苗 • 细菌的基因缺失疫苗 • DNA疫苗

25. 饲料用转基因微生物在我国也取得成功 • 转植酸酶酵母已通过农业部转基因生物安全评价，并已产业化生产和应用 • 近年来以转基因植物为表达系统的可食性疫苗也已成为我国的研究热点

26. 基因工程疫苗的产业化和商品化是我国在这一领域的发展方向基因工程疫苗的产业化和商品化是我国在这一领域的发展方向 • 如何提高基因工程疫苗免疫效力，达到或超过常规传统疫苗的免疫保护效果，以期在我国动物疫病的预防和控制中发挥作用，也是目前和今后我国科学家所面临的重要任务

27. 3.转基因微生物农药 • 杀虫转基因微生物 转基因病毒杀虫剂、转基因Bt制剂、防病转基因微生物。 • 转基因微生物肥料 遗传改良的联合固氮菌和根瘤菌。

28. 1、安全评价原则、技术指标要求 • 安全评价原则 • 安全评价内容及其技术指标要求

29. (1)安全评价原则 1、是以促进基因工程技术发展和应用，同时保障人类健康和生态环境的平衡为基本原则 2、采取个案分析，实事求是的原则 3、从受体微生物的安全性、基因操作的安全性和转基因动物用微生物遗传工程体及其产品的安全性等三个方面内容和对动物、人类与环境的安全性三个角度进行评价 （1）从动物安全的角度，着重评价转基因动物用微生物遗传工程体及其产品对靶动物和非靶动物的安全性 （2）从人类健康角度，着重评价对人类、畜禽以及形成的食物链（食品）的影响 （3）从生态环境角度，着重评价转基因动物用微生物遗传工程体及其产品对自然生态环境和畜牧业生态环境的影响

30. 4、涉及到危害人类、动物健康和生态环境平衡的转基因微生物遗传工程体及其产品，应对其安全性进行严格评价4、涉及到危害人类、动物健康和生态环境平衡的转基因微生物遗传工程体及其产品，应对其安全性进行严格评价 5、从事转基因动物用微生物研究的机构或个人应逐级申报。国外公司在我国申请注册的转基因动物用微生物遗传工程体及其产品，应按阶段进行安全性评价 6、农业部农业基因安全审评委员会仅负责对转基因微生物遗传工程体及其产品的安全性进行评价，因此通过安全性评价（指获得生物安全证书）的转基因微生物遗传工程体及其产品，需申报兽用新生物制品进行审批，获得兽用新生物制品证书后方能进行商品化生产和应用

31. （2）安全评价内容及其技术指标要求 • 安全性评价的总体内容 • 安全性评价的阶段及其要求 • 试验方案 • 主要动物用转基因微生物及其产品的安全性评价的相关技术资料

32. 1、安全性评价的总体内容 学名和分类地位，分布、繁殖方式 在环境中的定殖、存活和传播能力与途径及影响因素 致病性和产生毒素及毒性物质的能力， 在国内外的应用情况 （1）所用受体微生物(包括细菌、病毒) 可接触到的环境 （2）受体微生物的生物学背景与特性 （3）受体微生物对人类、动物和其它微生物的影响和 潜在的危险程度，受体微生物受人类和动物其它 病原体的侵染情况 受体微生物的安全性评价 与安全等级的确定 （4）受体微生物对生态环境的影响和 潜在的危险程度 （5）受体微生物的质粒状况，发生遗传 变异的可能性及其潜在危险程度 （6）对受体微生物的监测方法 和监控技术 受体微生物的安全性等级按《农业转基因生物安全评价管理办法》（第二章）确定

33. （1）目的基因的来源、结构、 免疫学与生物学功能和用途 （2）基因操作所用载体的名称、 来源、特性与结构、安全性，载体所带 的抗性标记基因及其特性 基因操作的安全性评价 内容与等级确定 （3）重组DNA分子的结构、构建 方法、复制特性和安全性 （4）转基因方法 （5）目的基因在受体微生物及宿主 体内的表达及其遗传稳定性 基因操作的安全性等级按《农业转基因生物安全评价管理办法》（第二章）确定

34. 转基因动物用微生物遗传工程体 及其产品的安全性评价内容 （1）转基因动物用微生物遗传工程体的分子学与生物学特性 （2）在自然界的存活能力 （3）遗传物质转移到其他生物体的能力和可能后果 （4）与其它病原微生物重组的能力和可能产生的后果 （5）遗传工程体的应用目的和范围 （6）对遗传工程体应有适当的监测方法和监控手段

35. 遗传工程体及其产品对动物的安全性 • 在靶动物和非靶动物体内的生存前景 • 对靶动物和可能的非靶动物高剂量接种后的影响 • 与传统的产品相比较，其相对的安全性 • 宿主范围与载体的漂移度 • 免疫动物与靶动物以及非靶动物接触时的排毒和传播能力 • 遗传工程体回复传代时的毒力返强能力 • 对妊娠动物的安全性 • 对免疫动物子代的安全性

36. 遗传工程体及其产品对人类的安全性 • 人类接触和感染的可能性及其危险性 • 广泛应用后对人类的潜在危险性

37. 遗传工程体及其产品对生态环境的安全性 • 遗传工程体在环境中释放的范围 • 影响遗传工程体在外界环境中的存活、增殖和传播的理化因素 • 感染靶动物和非靶动物的可能性或潜在的危险性

38. 2、安全性评价的阶段及其要求 • 中间试验 • 环境释放 • 生产性试验 • 安全证书申请

39. （1）中间试验 • 项目名称应包括目的基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表达鸡新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗在江苏省的中间试验 • 一份申请书中菌株不超过20个，且是由同一种受体微生物、相同的目的基因、相同的基因操作所获得的，而且每个转基因菌株都应有明确的名称或编号

40. 试验地点不超过3个省（市、区），每省不超过2个点试验地点不超过3个省（市、区），每省不超过2个点 • 试验动物总规模（上限） • 大动物（马、牛）20头 • 中小动物（猪、羊等）40头 • 禽类（鸡、鸭等）200羽 • 鱼2000尾 • 试验地点应明确试验所在的省（市、自治区）、县（市）、乡、村 • 试验年限一般为1~2年

41. 申报中间试验应提供以下相关附件资料 • 目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列 • 目的基因与载体构建的图谱 • 试验地点的位置图和试验隔离图 • 试验设计（包括进行安全性评价的主要指标和研究方法等，如转基因微生物的稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内的表达和消长关系等）

42. （2）环境释放 • 项目名称应包括目的基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表达鸡新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗NF16和YF9在江苏省的环境释放 • 一份申报书中菌株不超过5个，且是由同一种受体微生物、相同的目的基因、相同的基因操作所获得的，每个菌株都应有明确的名称或编号，并与中间试验阶段的相对应

43. 试验地点不超过3个省（市、区），每省不超过3个点试验地点不超过3个省（市、区），每省不超过3个点 • 试验动物总规模（上限） • 大动物（马、牛）100头 • 中小动物（猪、羊等）500头 • 禽类（鸡、鸭等）5000羽 • 鱼10000尾 • 试验地点应明确试验所在的省（市、自治区）、县（市）、乡、村 • 一次申请环境释放的期限一般为1~2年

44. 申请环境释放应提供以下相关附件资料 • 目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列 • 目的基因与载体构建的图谱 • 中间试验阶段的安全性评价试验总结报告 • 毒理学试验报告（如果必要的话） • 试验地点的位置图和试验隔离图 • 试验设计（包括进行安全性评价的主要指标和研究方法等，如转基因微生物的稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内的表达和消长关系等）

45. （3）生产性试验 • 项目名称应包括目的基因名称、动物用转基因微生物及产品名称、试验所在省（市、自治区）名称和试验阶段名称四个部分，如表达鸡新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗NF16在江苏省的生产性试验 • 一份申报书只能申请1种动物用转基因微生物，且名称应与前期试验阶段的名称和编号相对应

46. 试验地点应在批准过环境释放的省（市、自治区）进行，但不能超过2个省（市、区），每省不超过3个点试验地点应在批准过环境释放的省（市、自治区）进行，但不能超过2个省（市、区），每省不超过3个点 • 试验动物总规模（上限） • 大动物（马、牛）1000头 • 中小动物（猪、羊等）10000头（只） • 禽类（鸡、鸭等）20000羽 • 鱼100000尾 • 试验地点应明确试验所在的省（市、自治区）、县（市）、乡、村 • 一次申请生产性试验的期限一般为1~2年

47. 申请生产性试验应提供以下相关附件资料 • 目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列 • 目的基因与载体构建的图谱 • 环境释放阶段审批书的复印件 • 中间试验和环境释放安全性评价试验的总结报告 • 食品安全性检测报告（如果必要的话） • 目的基因或动物用转基因微生物向环境中的转移情况报告 • 试验地点的位置图和试验隔离图 • 试验设计（包括进行安全性评价的主要指标和研究方法等，如转基因微生物的稳定性、竞争性、生存适应能力、外源基因在靶动物体内的表达和消长关系等）

48. （4）安全证书的申请 • 安全证书的申请项目应包括目的基因名称、转基因微生物名称，如表达鸡新城疫病毒F基因的重且鸡痘病毒基因工程疫苗NF16的安全证书 • 一份申报书只能申请1种动物用转基因微生物，其名称应当与前期试验阶段的名称或编号相对应 • 一次申请安全证书的使用期限一般不超过5年

49. 申请安全证书应提供以下相关附件资料 • 目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列 • 目的基因与载体构建的图谱 • 目的基因的分子检测或鉴定技术方案 • 重组DNA分子的结构、构建方法；各试验阶段审批书的复印件 • 各试验阶段安全性评价试验的总结报告 • 目的基因或转基因微生物向环境中转移情况的报告 • 稳定性、生存竞争性、适应能力等的综合评价报告 • 对非靶生物影响的报告 • 食品安全性检测报告（如果必要的话） • 该类动物用转基因微生物在国内外生产应用的概况 • 其它相关资料

50. 3、试验方案 • 试验方案应明确： • 试验所在地区及畜禽场的名称及其周围的环境资料 • 试验所在区域的生态类型与动物种类 • 试验所在区域的动物疫病流行情况 • 试验所在区域生态环境对遗传工程体存活、繁殖、扩散和传播的有利或不利因素，特别是环境中其它生物从遗传工程体获得目的基因的可能性