Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών

1. Πανεπιστήμιο ΙωαννίνωνΣχολή Επιστημών ΥγείαςΤμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών «Αναλυτική Χημεία – Ενόργανη Ανάλυση» Εκχύλιση Χρωματογραφία (GC, HPLC) Δρ. Δημήτριος Στεργίου Διδάσκων Π.Δ. 407/80

2. Διαχωρισμοί – Εκχύλιση με διαλύτη • Συνήθως πριν την ταυτοποίηση και μέτρηση μίας ουσίας πρέπει να προηγηθεί διαχωρισμός ειδικά στην περίπτωση πολυσύνθετου δείγματος. • Εκχύλιση με διαλύτη: ονομάζεται η διαδικασία μεταφοράς μίας ουσίας από μία υγρή φάση σε μία άλλη υγρή φάση. • Οι δύο φάσεις είναι δύο μη αναμίξιμα υγρά (π.χ. ύδωρ / οργανικός διαλύτης). • Συντελεστής κατανομής: Έστω μία διαλυμένη ουσία S, η οποία κατανέμεται μεταξύ δύο φάσεων 1 και 2. Ισχύει: Κ = [S]2/[S]1

3. Διαχωρισμοί – Εκχύλιση με διαλύτη • Έστω η διαλυμένη ουσία S σε V1 mL διαλύτη 1 (ύδωρ), η οποία εκχυλίζεται με V2 mL διαλύτη 2 (τολουόλιο). Αν nείναι τα mol της S στο σύστημα, q και (1-q) το κλάσμα αυτής που παραμένει στη φάση 1 και 2 αντίστοιχα ο συντελεστής κατανομής θα δίνεται από τη σχέση: • Κανόνας: Είναι πιο αποτελεσματικό η εκχύλιση να γίνεται πολλές φορές και με μικρούς όγκους παρά λίγες και με μεγαλύτερους όγκους.

4. Χρωματογραφία • Διαδικασία διαχωρισμού, που βασίζεται στην κατανομή του αναλύτη ή των αναλυτών μεταξύ δύο φάσεων, της στατικής και της κινητής. Η διαδικασία γίνεται εντός μίας στήλης, που ονομάζεται χρωματογραφική στήλη. • Στατική φάση: είναι το υλικό πλήρωσης της στήλης και παραμένει σταθερό μέσα σε αυτή. Συνήθως είναι ένα υγρό μεγάλου ιξώδους χημικά δεσμευμένο στα εσωτερικά τοιχώματα της στήλης ή στην επιφάνεια στερεών σωματιδίων ή και μη τροποποιημένα στερεά σωματίδια. • Κινητή φάση: είναι το ρευστό που κινείται στο εσωτερικό της στήλης και μπορεί να είναι ένα υγρό ή ένα αέριο. • Διαλύτης έκλουσης: το ρευστό που εισάγεται στη στήλη. • Έκλουσμα: το ρευστό που εξέρχεται από τη στήλη. • Έκλουση: η διαδικασία διέλευσης του διαλύτη έκλουσης από τη χρωματογραφική στήλη.

5. Χρωματογραφία • Η διαλυμένη ουσία Α εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια προς τη στατική φάση σε σχέση με την ουσία Β οπότε παραμένει περισσότερο χρόνο στη στήλη.

6. Χρωματογραφία • Χρωματογράφημα: είναι η γραφική απεικόνιση της απόκρισης του ανιχνευτή σε συνάρτηση με το χρόνο έκλουσης. • Χρόνος κατακράτησης (tr): ο χρόνος, που απαιτείται για να φτάσει η ουσία στον ανιχνευτή από τη στιγμή της εισαγωγής του δείγματος στη στήλη. • Όγκος κατακράτησης (Vr): ο όγκος της κινητής φάσης, που απαιτείται για την έκλουση μία συγκεκριμένης διαλυμένης ουσίας. • Ρυθμισμένος χρόνος κατακράτησης (tr΄): ο χρόνος, που απαιτείται για τη μετακίνηση της ουσίας κατά μήκος της στήλης, πέραν του χρόνου (tm) στον οποίο εξέρχεται ο διαλύτης. • Σχετική κατακράτηση (α): είναι το πηλίκο των ρυθμισμένων χρόνων κατακράτησης.

7. Χρωματογραφία • Χρωματογράφημα: είναι η γραφική απεικόνιση της απόκρισης του ανιχνευτή σε συνάρτηση με το χρόνο έκλουσης.

8. Είδη Χρωματογραφίας

9. Αέρια Χρωματογραφία (GC) • Κινητή φάση: αέριο (He, N2, H2). • Στατική φάση: στερεό υλικό ή συνήθως μη πτητικό υγρό το οποίο είτε επικαλύπτει το εσωτερικό της στήλης είτε είναι προσροφημένο σε στερεά σωματίδια. • Αναλύτης: αέριο ή πτητικό υγρό.

10. Είδη στηλών στην GC • Πληρωμένες στήλες: περιέχουν λεπτά σωματίδια στερεού υλικού επικαλυμμένα με μία μη πτητική υγρή στατική φάση. Επίσης, το ίδιο το στερεό μπορεί να αποτελεί τη στατική φάση. • Ανοικτές σωληνοειδείς στήλες: σε σχέση με τις πληρωμένες στήλες έχουν: (1) υψηλότερη διαχωριστική ικανότητα, (2) μικρότερο χρόνο ανάλυσης, (3) μεγαλύτερη ευαισθησίακαι (4) μικρότερη χωρητικότητα δείγματος. • Διακρίνονται στις: 1. WCOT 2. SCOT 3. PLOT • Προστήλες: Προστατευτικό ρόλο.

11. Αέρια Χρωματογραφία (GC) • Ποιοτική ανάλυση: γίνεται με φασματομετρία μάζας (MS) ή FT-IR κάνοντας χρήση βάσεων δεδομένων. Επίσης, γίνεται και με σύγκριση του χρόνου κατακράτησης του αγνώστου με ένα πρότυπο δείγμα. • Ποσοτική ανάλυση: γίνεται με ολοκλήρωση της περιοχής που καταλαμβάνει η κορυφή και εύρεση του εμβαδού αυτής. Στη γραμμική περιοχή συγκεντρώσεων το εμβαδόν της κορυφής είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του αναλύτη.

12. Είδη ανιχνευτών στην GC • Θερμικής αγωγιμότητας (TCD): είναι οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενοι. Έχουν μικρότερη ευαισθησία στην ανίχνευση μικρών ποσοτήτων αναλύτη. • Ιονισμού φλόγας (FID): το έκλουσμα καίγεται με ένα μίγμα Η2 και αέρα. Χρησιμοποιείται κυρίως για την ανίχνευση υδρογονανθράκων στους οποίους εμφανίζει μεγάλη ευαισθησία. • Σύλληψης ηλεκτρονίων (ECD): είναι ευαίσθητος σε μόρια που περιέχουν αλογόνα, συζυγιακά καρβονύλια, νιτρίλια, νιτροενώσεις και οργανομεταλλικές ενώσεις. Αντίθετα παρουσιάζει μικρή ευαισθησία σε υδρογονανθρακές, αλκοόλες και κετόνες. • Αζώτου – Φωσφόρου (NPD): πρόκειται για έναν τροποποιημένο FID, ο οποίος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος σε ενώσεις που περιέχουν Ν και P.

13. HPLC • Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ή πίεσης (HPLC): χρησιμοποιεί υψηλή πίεση για να εξαναγκάσει το διαλύτη (κινητή φάση) να κινηθεί διαμέσου της στήλης, η οποία περιέχει τη στατική φάση. • Βασικά μέρη μίας διάταξης HPLC: 1. Δοχεία διαλυτών. 2. Αντλίες (40 – 700 bar). 3. Σύστημα έγχυσης. 4. Στήλη. 5. Ανιχνευτής.

14. Στήλες HPLC • Στήλες στην HPLC: ατσάλινες ή πλαστικές στήλες, οι οποίες είναι πληρωμένες με τη στατική φάση. Συνήθως προηγείται αυτής μία προστήλη που έχει προστατευτικό ρόλο. • Η στήλη περιέχει τη στατική φάση, η οποία μπορεί να είναι: 1. υψηλής καθαρότητας σφαιρικά μικροπορώδη σωματίδια πυριτίας (προσρόφησης, pH < 8.0). 2. πυριτία τροποιημένη με C18 (στατική φάση ομοιοπολικά συνδεδεμένη)

15. Έκλουση στην HPLC • Στη χρωματογραφία προσρόφησης τα μόρια του διαλύτη ανταγωνίζονται με τα μόρια της ουσίας για τις θέσεις της στατικής φάσης. • Ο κάθε διαλύτης έχει μία ισχύ έκλουσης, ανάλογα με την ικανότητά του να εκτοπίζει ουσίες από τη στατική φάση. Η ισχύς έκλουσης καθορίζεται και από τη πολικότητα της στατικής φάσης. • Ισοκρατική έκλουση: χρησιμοποιείται ένας διαλύτης ή μίγμα διαλυτών με σταθερή σύσταση κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. • Βαθμωτή έκλουση: χρησιμοποιείται μίγμα διαλυτών με συνεχώς μεταβαλόμμενη σύσταση κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, με σκοπό την αύξηση της ισχύος έκλουσης.

16. Κατηγορίες HPLC • Ανάλογα με την πολικότητα της στατικής φάσης διακρίνουμε τη χρωματογραφία κανονικής φάσης και τη χρωματογραφία ανάστροφης ή αντίστροφης φάσης. • Χρωματογραφία κανονικής φάσης (NP-HPLC): η στατική φάση είναι πολική και οι πολικότεροι διαλύτες έχουν μεγαλύτερη ισχύ έκλουσης. • Χρωματογραφία ανάστροφης ή αντίστροφης φάσης (RP-HPLC): η στατική φάση είναι μη πολική και οι λιγότερο πολικοί διαλύτες έχουν μεγαλύτερη ισχύ έκλουσης. • Η RP-HPLC πλεονεκτεί στο γεγονός ότι: α) η στατική φάση είναι πιο ευπροσάρμοστη σε αλλαγές της σύστασης της κινητής φάσης, ευνοώντας έτσι τη χρήση προγραμμάτων βαθμωτής έκλουσης, β) η πολικότητα της στατικής φάσης μπορεί να ρυθμιστεί πολύ πιο εύκολα, γ) ευνοεί το διαχωρισμό μορίων βιολογικής προέλευσης, καθώς και ενώσεις με ευθύγραμμες ή διακλαδισμένες αλυσίδες.

17. Ανιχνευτές στην HPLC • Υπεριώδους: ο πιο συνηθισμένος είναι εκείνος που κάνει χρήση συστοιχίας φωτοδιόδων (καταγραφή όλων των μηκών κύματος). Αποκρίνεται σε όλες σχεδόν τις ενώσεις. • Φθορισμού: είναι πολύ ευαίσθητοι αλλά οι χρήση τους περιορίζεται στις ενώσεις που φθορίζουν. • Δείκτη διάθλασης: είναι 1000 φορές πιο ευαίσθητος σε σχέση με τον ανιχνευτή υπεριώδους, αποκρίνεται σε όλες σχεδόν τις ουσίες αλλά δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη βαθμωτή έκλουση. • Ψεκασμού σκέδασης φωτός: αποκρίνεται σε κάθε αναλύτη, ο οποίος είναι σημαντικά λιγότερο πτητικός από την κινητή φάση. • Ηλεκτροχημικός: αποκρίνεται σε αναλύτες, οι οποίοι μπορούν να οξειδωθούν ή να αναχθούν (π.χ. φαινόλες, αρωματικές αμίνες, υπεροξείδια κ.α.).