запрограммированная смерть микроорганизмов.

1. запрограммированная смерть микроорганизмов. Федор Северин НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ severin@mail.genebee.msu.ru http://yeastmolbiol.belozersky.msu.ru

2. клетка клетка клетка клетка Истощение среды роста Неблагоприятные условия Оторванная от коллектива Неблагоприятные условия В окружении других клеток “Альтруистическая смерть”

3. PCD in autolysis of S. pneumoniae. Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi:10.1128/MMBR.64.3.503-514.2000

4. Model of the fate of a bacterial population. GASP – growth advantage at stationary phase Lewis K Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; doi:10.1128/MMBR.64.3.503-514.2000

5. Слизевики У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб сытые споры Плодовое тело цАМФ смерть голодные “Альтруистическая смерть” Истощение среды роста Выяснение кто слабый Слабые жертвуют себя в пользу сильных Высокая плотность клеток

6. «классический» апоптоз: Сигнал (повреждение ДНК, гормон….) Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного пространства цитохром с связывется сAPAF APAF активирует каспазы

7. Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей Saccharomyces cerevisiae • Образование АФК (активных форм кислорода) • Выход цитохрома с из митохондрий • Фрагментация ДНК на ранних этапах • Переход фосфатидилсерина из внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны • Чувствительность к ингибиторам синтеза белка • Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных : • метакаспаза • AIF 5 мкм Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п.

8. альфа α α α Saccharomyces cerevisiae феромоны Альфа-фактор Было известно:большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей. Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти б

9. Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой альфа-фактора АФКФазаФлоксин Б (мертвые клетки) -феромон +феромон мутантste20 + феромон

10. Насколько физиологична 100-кратная доза феромона? Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящего слияние клеточных стенок без добавок + хлорохин Окраска флоксином Б Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромонов достигают смертельных значений

12. Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или нокаутом белка Ysp1 Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный лизис клеток, а активный каскад

13. Изучение механизма феромон-зависимой смерти: опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле. Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо Феромона использовали искусственный индуктор повышения концетрации кальция Амиодарон, 80 мкМ «пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК) «миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи «ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге «F» - FCCP, протонофор (разобщитель) Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти?

14. FCCP + H Дыхательная цепь “протечка” АТФ-синтаза + H почему снижение сопротивления мембраны может быть полезным?

15. Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997

16. Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий

17. Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном? олигомицин FCCP + H Дыхательная цепь “протечка” АТФ-синтаза + H

18. Концентрация кислорода Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны

19. Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS) FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает. Почему нокаут улучшает выживание?

20. реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических срезов через клетку 10 мкм нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий

21. Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада - с помощью скринирования делеционной библиотеки 5 мкм Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий

22. почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти?

23. почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клетку от смерти? набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий

24. возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2 фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий? При этом площадь поверхности не изменяется, а максимальный суммарный объем уменьшается

25. Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining Normal mitochondria network Depolarized mitochondria (dead cells) Mosaic staining JC-1 staining of amiodarone treated cells 11% WT 1% 88% Δysp2 35% 2% 63%

26. laser Laser hit experiments laser

27. Wild-type cells ysp2-delta cells A Before laser After laser ЛАЗЕР?? 5 min 10 min

28. Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте

29. Модель каскада феромон-зависимой смерти феромон рецептор амиодарон ∆ste20 подъем [Ca] в цитоплазме синтез белка циклогексимид подъем уровня сопряжения подъем ∆Ψ АФК Ysp1, Ysp2-зависимая фрагментация митохондрий падение ∆Ψ, выход цитохрома ц (1) (5) (6) (2) (1а) митохондрия низкий FCCP миксотиазол NAC, токоферол ∆ysp1, ∆ysp2 (7) (4) (3) (8) (9) (10) смерть клетки

30. Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997 как снизить мембранный потенциал «мягким» образом?

31. использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации Б C12TPP SkQ1 Положительно-заряженные протонофоры (ионыкласса SkQ)

32. использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации Б C12TPP SkQ1 Положительно-заряженные протонофоры (ионыкласса SkQ)

33. Стимуляция дыхания Низкий pH в цитоплазме тормозит дыхательную цепь. Поэтому при закислении среды добавка FCCP не стимулирует потребление кислорода C12-TPP В отличии от FCCP, положительно- заряженный протонофор ускоряет дыхание даже при pH=3 в среде С12TPP – мягкий митохондриально- адресованный протонофор. Перспективное вещество для применения в медицине. Сейчас идут испытания на мышах

34. повреждающее и защитное действие АФК Иногда в ответ на ухудшение условий клетка вырабатывает количество АФК, достаточное для индукции анти-оксидантных систем и таким образом «готовится» к более сильным стрессам. Рассматривая популяцию дрожжевых клеток, логично ожидать, что относительно небольшой стресс будет индуцировать защитные АФК, а высокий уровень стресса (достаточный для массированного повреждения генома клетки) вызовет АФК-индукторы каскада смерти

35. метилметансульфонат (ММС) – метилирующий агент, повреждающий ДНК Ионол (анти-оксидант) контроль Менадион (про-оксидант)

36. Другие про-оксиданты действуют подобно менадиону

37. Окраска на АФК контр С12ТРР СTAB SDS Морфология митохондрий C12TPP в высокой концентрации – мягкий про-оксидант

38. А В Синхронизованные клетки ММС Выживание, % катаболизм ДНК-связывающие другие ответ на стресс Н2О2 менадион ММС, мкМ Б Ингибирование транскрипции убирает защитное действие про-оксидантов Выживание, % Защитное действие про-оксидантов опосредовано их эффектом на экспрессию генов менадион актиномицин + С12-ТРР актиномицин + менадион С12-ТРР без добавок актиномицин

39. Механизм токсичности агрегации белков, вызванной удлиненными полиглутаминами (полиQ). Экспрессия полиQ-CFP в дрожжах. CFP- синий цвет, иодид пропидия (мертвые клетки) – красный, FITC-VAD-fmk (детекция каспазной активности) – зеленый.

40. 103Q накапливаетсяв ядре, делеция дрожжевого гомолога каспаз предотвращает это накопление. Следовательно, 103Q-зависимаясмерть – активный процесс. Значит, можно пытаться прервать каскад нокаутом гена. ко-локализация, %

41. Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, % Дикий тип нокауты гипер- экспрессия Ase1 – субстратциклосомы

42. регуляция клеточного цикла циклины Cdk1 этапы фаза деления циклосома (APC-Cdc20 и APC-Cdh1) поли-убиквитинирование циклинов деградация циклинов в протеасоме переход в G0/G1

43. рабочая модель:

44. Отношение размеров колоний при и без индукции 103Q, % Дикий тип нокауты гипер- экспрессия

45. Δclb6, 103Q 103Q Δclb6 контроль • накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.

46. Δclb6, 103Q 103Q Δclb6 контроль • накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q. а какова ситуация при нейродегенеративных заболеваниях?