Purificação e Caracterização do anticorpo anti-DRG 11b

1. BiologiaCelularemolecular Purificação e Caracterização do anticorpo anti-DRG 11b Orientador: Prof. Dr. Carlos Reguenga Autores: Ana Filipa Pereira Liliana Sofia Coelho

2. DRG11 • O Drg11 é um factor de transcrição, expresso nos gânglios raquidianos e no corno dorsal da espinal medula, durante a vida embrionária (a expressão do drg11 decai após o nascimento). • Drg11 participa no desenvolvimento de neurónios envolvidos no processamento da sensação dolorosa.

3. Sistema Nociceptivo Gânglio dorsal → Corno dorsal Produção da resposta. Nervo sensorial leva a informação à espinal medula. Percepção do estímulo pelo órgão receptor

4. 47,5 Kb Drg11 gene DRG11 DRG11b DRG11 263 a.a. C N OARdomain homeodomain N C homeodomain Ligação ao DNA Regulação DRG11b 220 a.a. Organização genómica Gene drg11 → cromossoma 14

5. DRG11 MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67 DRG11b MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67 ******************************************************************* DRG11 MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133 DRG11b MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133 ****************************************************************** DRG11EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKGGPLCSCCVPDPMGLSFLPTYGCQ 199 DRG11b EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKDHFRAMLCSGSFGFRGEQTQQRAL 199 ****************************************** * DRG11 SNRTASVAALRMKAREHSEAVLQSANLLPSTSSSPGPASKQAPPEGSQDKTSPTKEQSEGEKSV263 DRG11b TPNLYPFLIDERCSAVDMTQG------------------------------------------- 220 O anticorpo anti-drg11b foi criado usando um péptido de 15 a.a.. Este foi escolhido na sequência da drg11b que difere da drg11.

6. O anticorpo foi produzido com a finalidade de se poder estudar o papel da proteína drg11b nos mecanismos de processamento da dor.

7. Objectivo Purificar e testar o anticorpo anti-DRG 11b. Ferramenta para estudar o papel do drg11b no desenvolvimento do sistema nociceptivo.

8. Material Inicial Soro de coelhos imunizados com o péptido (FGFRGEQTQQRALTP) específico do Drg11b.

9. Purificação do anticorpo • Cromatografia por afinidade Baseia-se na interacção do anti-drg11b com o péptido ligado a uma resina Lavagens da resina-péptido drg11b Incubar com o soro “overnight” Separação do sobrenadante Montagem da coluna

10. Eluição por choque de pH (pH 3.0) Recolha de 10 fracções com bomba peristáltica Neutralização com Tris (pH=8.0)

11. 2. Testar o anticorpo • Dot blot Colocamos o péptido DRG11b numa membrana de nitrocelulose Colocamos as membranas numa solução de bloqueio Incubamos com o anticorpo purificado overnight Incubamos com o anticorpo secundário conjugado com a fosfatase alcalina

12. 12 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Soro Soro após resina Revelação com substratos Resultado Conclusão: o anticorpo encontrava-se maioritariamente presente nas fracções 3 e 4.

13. 2. Testar o anticorpo O anticorpo foi posteriormente testado por imunocitoquímica. Não foram obtidos resultados positivos. Concentrar o anticorpo.

14. 25KDa 50 KDa 150 KDa 3. Concentração do anticorpo • As imunopurificações foram repetidas várias vezes e as fracções 3 e 4 misturadas. • Colocou-se a solução final num centricon (tubo com uma membrana que retém proteínas maiores que 30 kDa). • Centrifugação a 2500 rpm.

15. Imunocitoquímica 4. Testar o anticorpo concentrado Usaram-se lâminas com cortes de embrião E13.5 e E16.5 de ratinhos wild-type Desparafinação (banhos em soluções de xilol, de seguida concentrações decrescentes de etanol e por fim água). Bloqueio com soro

16. Incubaram-se os cortes com o anticorpo primário (anti-DRG 11b) e como controlo positivo com anti-drg11 Incubaram-se com anticorpo secundário conjugado com um fluorocromo vermelho Observaram-se os locais de expressão da proteína usando microscopia de fluorescência

17. E13.5 E13.5 E16.5 Anti-Drg11 (reconhece Drg11 e Drg11b) Anti-Drg11b É possível que o anticorpo não tenha reconhecido a proteína pelo o facto do epítope poder estar mascarado pelo folding da proteína.

18. Western-blotting com extractos de medula espinal de embriões 1. Preparação da electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%. 2. Preparação das amostras de medula espinal com idades (embrionárias e pós-natais)diferentes.

19. E18 Marcador E15 P7 P14 E15 E18 P7 P14 3. Colocaram-se as soluções nos poços formados pelo pente no gel, como esquematizado abaixo. Marcador: contem uma mistura de proteínas de tamanho conhecido.

20. 5. No final da electroforese, transferiram-se as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose. 6. Cororou-se com Panceau S. 7. Incubaram-se com o anti-drg11 (reconhece tanto drg11 como drg11b) e com o anticorpo anti-drg11b concentrado. 8. Revelação pelo método quimioluminescente 97kDa 66kDa 45kDa 31kDa 21kDa Anti-drg11 Anti-drg11b

21. Conclusão quimioluminescência Não foram obtidos resultados. O anticorpo não tem sensibilidade suficiente para detectar o Drg11b por métodos desnaturantes.

22. Com este conjunto de experiências podemos concluir que o anticorpo não é funcional. Ponderações • O anticorpo só reconhece a proteína apenas em grandes quantidades (resultado do dot blot). • O anticorpo não tem sensibilidade para detectar a proteína com os métodos utilizados.

23. Perspectivas futuras • Produção de uma proteína recombinante correspondente à parte C-terminal específica do Drg11b de modo a produzir um novo anticorpo. • Imunoprecipitação das bandas reconhecidas pelo anti-Drg11 e identificação por espectroscopia de massa (MALDI-MS). • Experiências de hibridação “in situ” com sondas específicas para o exão de cada uma das isoformas.

24. Agradecimentos • Professor Doutor Carlos Reguenga • Laboratório Biologia Celular e Molecular