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包埋與切片技術. 石蠟包埋之步驟 固定 （ Fixation ） 脫水 （ Dehydration ） 澄清 （ Clearing ） 浸潤 （ Infiltration ） 包埋 （ Embedding ） 切片 （ Sectioning ）. 包埋，就是將已經過固定，脫水，透明，浸蠟的 組織塊從最後的蠟浴取出置入充滿熔融石蠟的包埋框內，包埋成塊 ，使組織和包埋劑相溶一體並迅速冷卻，這個程式稱為包埋。包埋劑凝固後，進一步加強了組織的硬度和韌度而便於進行切片。. 1. 石 蠟包埋法.
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石蠟包埋之步驟 • 固定（Fixation） • 脫水（Dehydration） • 澄清（Clearing） • 浸潤（Infiltration） • 包埋（Embedding） • 切片（Sectioning）
包埋，就是將已經過固定，脫水，透明，浸蠟的組織塊從最後的蠟浴取出置入充滿熔融石蠟的包埋框內，包埋成塊，使組織和包埋劑相溶一體並迅速冷卻，這個程式稱為包埋。包埋劑凝固後，進一步加強了組織的硬度和韌度而便於進行切片。包埋，就是將已經過固定，脫水，透明，浸蠟的組織塊從最後的蠟浴取出置入充滿熔融石蠟的包埋框內，包埋成塊，使組織和包埋劑相溶一體並迅速冷卻，這個程式稱為包埋。包埋劑凝固後，進一步加強了組織的硬度和韌度而便於進行切片。
1.石蠟包埋法 石蠟包埋法是製作光學顯微鏡切片的常規方法，它有許多優點，操作簡易便於掌握，可進行連續切片，包埋後的組織可以長期保存。 包埋的方法有自動包埋機包埋和手工包埋兩種。 • 手工包埋的步驟如下： • 1.組織浸入石蠟後，包埋前將組織移入包埋用石蠟杯內。從恒溫箱取出置於三角架上，其下點燃酒精燈，以保持石蠟的溶解狀態。 2.準備好包埋框，將包埋用的鑷子在酒精燈上加溫（防止鑷子粘蠟）後，左手持蠟杯，右手把加溫的鑷子放在蠟口（直立狀）倒蠟時讓石蠟沿鑷子注入包埋框內。
3.迅速鑷取組織塊放入包埋框石蠟內，切面朝下放正置入框底並輕輕壓平，以保證不再有氣泡。3.迅速鑷取組織塊放入包埋框石蠟內，切面朝下放正置入框底並輕輕壓平，以保證不再有氣泡。 4.待石蠟表面凝固前將標籤貼於其上，需注意勿使標籤與標本混淆，當蠟塊冷至蠟面有一層透明蠟膜時，浸入冷水中迅速使其冷卻，否則蠟內常形成結晶。 5.蠟塊完全硬固後除去銅框，以保證蠟徹底凝固，立即修切，準備製成切片或儲藏備用。
2.石蠟包埋的注意事項 1.作為包埋組織使用的石蠟不僅由於氣候的不同需要加以選擇，而且與組織的硬度也有密切關係，過硬的組織最好用硬度較高的石蠟包埋，反之，軟組織則應以硬度較低的石蠟包埋。其熔點一般要求在60℃左右。 2.包埋用石蠟加溫不可過高，以保持其不凝固為原則，溫度過高容易將組織燙壞，使得組織變硬，變脆，並發生捲曲，收縮變形而不利於切片，甚至影響診斷。另外注意埋蠟的溫度和組織本身的溫度，兩者是否合適，溫度不一致常可造成組織與周圍石蠟脫裂的現象，而達不到包埋的作用。 3.包埋用石蠟應掌握用量，以組織全部包埋完畢，石蠟也恰好用完為宜。
4.包埋應注意組織病變面放在下面，並盡可能使組織放平，在不損傷組織的情況下可用鑷子輕壓。 5.囊壁和消化道等組織包埋時更應注意組織方位，應將組織塊直立拉平，不要捲曲。 6.相同組織如包埋於一個蠟塊時，除包平外，還要注意方向的一致，以利切片。 7.多塊組織和碎組織包埋於一個蠟塊內時，組織的排列一定要密擠靠近，以求成直線或方塊行，這樣有利於切片。 8.石蠟包埋後，不宜冷凝過慢，特別是室溫較高時，石蠟凝固後應立即投入冷水中加速冷卻可增加石蠟密度，韌性和硬度。但冷凝過速也會因為內外溫差過大造成蠟塊裂損。
3.快速石蠟包埋法 快速切片診斷是在數十分中或半小時左右製成切片並作出診斷的一種手段，主要用於手術中決定手術的切除範圍和手術方式。快速切片的方法包括冰凍切片和快速石蠟切片。製作快速石蠟切片時，切取組織應該薄小，從固定、脫水到浸蠟的全過程都要加溫，一般是先將各種試劑在超聲波快速石蠟脫水儀中預熱，恒溫下操作，整個過程大約在10－15分鐘即可完成。
操作過程：（1）先取病變組織於AF中固定3－5分鐘。（2）95％酒精1分鐘。（3）無水酒精1分鐘（4）正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分鐘（5）二甲苯1分鐘（6）浸蠟1－2分鐘（7） 包埋，將組織置於預先備置的蠟塊中（固體石蠟包埋法）;預備一硬蠟塊，用熱鑷子於蠟塊中間熔蠟一小部分，在以熱鑷子從蠟杯內取出已與石蠟飽和之組織塊投入融蠟中，冷固後，立即進行石蠟切片。石蠟切片附貼後，在火上稍加烘烤使組織切片上石蠟全部熔化，水分也被烘乾，然後投入二甲苯，100％酒精，95％酒精各30秒脫蠟，入水沖洗，常規蘇木素，伊紅染色。
胃、腸粘膜組織快速製作法1．10%緩衝福馬林5 mins。2．80%酒精5mins。3．90%酒精5mins。4．95%酒精5mins。5．100%酒精5mins6．二甲苯 5mins7．石 蠟 15mins
注意事項：1．全部步驟都在65℃的恒溫箱中進行。2．浸蠟也可在酒精燈上進行，但要小心，浸蠟溫度過高，也可導致組織變脆。3．包埋時，可用預先製作的蠟模(這樣可節省石蠟硬化的時間)用鑷子在酒精燈上燒紅，然後點於蠟膜上，將組織放進去，然後放入冰箱的冰枚中凍起來，即可切片。4．如遇取材多個部位多塊組織時，就不能用上述的方法，否則多塊組織包在一起時，不能處於同一水平面上，不利於切全組織。注意事項：1．全部步驟都在65℃的恒溫箱中進行。2．浸蠟也可在酒精燈上進行，但要小心，浸蠟溫度過高，也可導致組織變脆。3．包埋時，可用預先製作的蠟模(這樣可節省石蠟硬化的時間)用鑷子在酒精燈上燒紅，然後點於蠟膜上，將組織放進去，然後放入冰箱的冰枚中凍起來，即可切片。4．如遇取材多個部位多塊組織時，就不能用上述的方法，否則多塊組織包在一起時，不能處於同一水平面上，不利於切全組織。
鼻咽部粘膜、宮內膜及穿刺物快速製作法。1．10%緩衝福馬林固定 5-10mins。2．80%酒精 5-10mins。3．90%酒精 5-10mins。4．95%酒精 5-10mins。5．100%酒精 5-10mins。6．二甲苯 5mins。7．浸蠟 20mins注意事項：上述步驟都於65℃恒溫箱中進行。
4.超聲波快速石蠟製片法 • 臨床檢驗用常規石蠟製片法制作，病理報告如沒特殊情況，一般都需要三天才能發出。其程式基本是活檢當天下午取材，晚上組織脫水及浸蠟，第二天上午包埋切片及染色，當切片送達醫生手裏時，已是第二天的上午，下午看閱切片，至複檢醫生手裏時，已是第三天的時間了。這是一般的工作時間，可這對於急需獲得病理結果的患者來說，三天時間確實太長，尤其是門診病人，遠道求醫的患者，或者外地甚至國外的患者，三天的時間就意味著等待，住宿及消費。為了解決上述的問題，減少患者的經濟負擔，為患者蠃來保貴的治療時間，超聲波快速石蠟製片法可勝任此項工作。
超聲波的工作原理：超聲波的高頻振諧下以每秒80萬次作縮張運動，在此掁諧下，也促進了被超聲波所作用的試劑中分子的運動。由於分子運動加快，加速了組織與各種試劑的反應，使整個操作程式在短時間內完成。超聲波的工作原理：超聲波的高頻振諧下以每秒80萬次作縮張運動，在此掁諧下，也促進了被超聲波所作用的試劑中分子的運動。由於分子運動加快，加速了組織與各種試劑的反應，使整個操作程式在短時間內完成。
超聲波快速石蠟製片法程式：幾種不同組織處理時間表(mins)超聲波快速石蠟製片法程式：幾種不同組織處理時間表(mins)
注意事項： • 1．本法中所用的脫水劑為丙酮，它比酒精具有更強的脫水作用。雖然從理論上講，它對組織具有很強的收縮作用，但為了能在短時間內使組織能夠徹底脫水，不得不首選它。從已做的近千例次的實驗中認為，它與常規切片相比較，沒有什麼區別。2．有人提出，既然要快，何不用冰凍切片來製作，對於這個問題，肯定的回答是不能。因為冰凍切片與石蠟切片不一樣，雖然目前機器及技術都是一流，制出切片近似於石蠟切片，但還是達不到石蠟切片的好，切片不能作長期保存，這就會影響檔案的保管和資料的積累。3．為了減少組織的收縮，脫水劑第一缸用酒精代替，但為了使組織獲得徹底脫水，時間要相對延長些。4．丙酮沸點較低，70℃左右就會沸騰，如此揮發較快，因此組織脫水時，注入丙酮的量要夠，否則很容易使其乾涸。5．操作時要仔細觀察，組織如果沒到編程的時間，就已浮於脫水劑的上面，說明組織已經徹底脫水，可提前進入下一步。6．切片後的染色，可用超聲波來染色。
5.石蠟包埋機包埋法 • 1、 打開電源總開關，讓包埋機處於工作狀態。2、 調高溫度，讓包埋蠟溫至65度左右。3、 打開冷凍台。4、 取出包埋模型，由腳踩踏或手控制出蠟，注入少量的石蠟後，挾入組織塊，小的多塊組織應放在一起，大塊組織應壓平，管狀和皮膚組織應豎起來包埋，然後再壓上包埋盒，包埋盒上再注入少量石蠟，包埋完後，將其置於冷凍臺上，旁邊備有一盒冷水，當冷凍臺上的包埋塊表面出現凝結時，迅速將它放入水中，然後取出蠟塊，修削去周邊的餘蠟，按順序排列好於4°C冰箱或冰格中凍起來備用。
石蠟切片 • 以石蠟製作的切片，可以製成極薄的切片。一般的切片厚度要求在4—6微米。而石蠟切片不但可以達到這個要求，甚至可以切得更薄到2微米以至1微米。這一點是冰凍切片和火棉膠切片難以獲得的結果。另外，石蠟切片還便於製作大批的或是連續的切片。而且以石蠟包埋的組織塊便於長期保存。所以石蠟切片是目前各種切片製作方法中最普通常用的一種方法。
1.蠟塊的修切 • 不管是組織包埋機包埋的蠟塊也好，還是傳統法包埋的蠟塊，切片前都需要很好的修切，才能更適合於切片。前者包埋的蠟塊，包埋盒周邊的石蠟，一定要去除掉，否則切片時，切片機上的持蠟器，將無法將其夾上，影響切片中間的部分，視組織的大小而確定是否需要修切，比如組織小米粒大小，這時應將周邊多餘的石蠟削去，按要求組織塊周邊的餘蠟留有0.5CM即可，削去餘蠟後，對於細小的組織，一張玻片可以多裱上幾個組織塊，對於疾病的觀察大有好處。削去餘蠟的另一個好處是延長切片刀的使用壽命，保證一把刀（一次性刀片）多切一些蠟塊，因為餘蠟的存在，在切片時，增加了刀口的磨擦，使刀口容易鈍化。
2.切片前的準備 1、恒溫水浴鍋首先預熱至35℃—40℃。 2、蠟塊整修 • 3．載玻片應事先洗滌乾淨，無油膩和不透明現象，應將載玻片浸入酸缸內12小時後流水沖洗，再烤幹備用。根據切片需要張數，每片塗上一層極薄的蛋白甘油，插於載片板（或載片架）上備用。 蛋白甘油的配製：取新鮮雞蛋1份加甘油1份再加適量麝香草酚攪勻。此法主要是防止脫片，實際上一張很清潔的載玻片不塗蛋白甘油也不會脫片。 4、將鋒利的刀片裝入切片刀夾鉗內，調整角度和位置後隨即緊固，檢查切片刀的傾斜度是否正確，傾角過大、則切片上卷；傾角過小則切片皺起，以20°-30°為佳。 5、備用小型毛筆、小型無鉤鑷子、鉛筆。
3. 石蠟切片機 • 目前，國內外常規使用的切片機有兩種型號，它們是：1、 輪轉式石蠟切片機 2、 平推式切片機（軌道式） 旋轉式切片機：利用螺旋原理切取組織蠟塊，可作連續切片，易學乃其優點，適用於學生實習使用 滑動式切片機:以滑動方式切取蠟塊，多用於單片切片，蠟塊換取方便、快速，適用於工作量大的實驗室。
4.切片烘烤箱 • 1、市售切片烘烤箱，該箱配有裱片用的溫水控制部分，另一半為切片的烘烤部分，溫度可進行調節，範圍在0—100度間，邊切片邊烤片，這是最為理想的手段，其好處是，如果裱片時，有個別小部沒裱好，發生皺折，及時的烘烤可將其烤平。另者，當切完最後一張時，前面的已烘烤差不多了，不用再費多少時間就能烤好切片。2、 自做烘烤箱，這根據各單位的情況進行製作，可以製作一個木箱，上面用鋁板製成，在前部挖一個口子，剛好放進一個鋁制飯盒，這個可作為裱片用，內將四個40—60W燈泡，外裝開關控制，這便是一個烘烤箱。
5.小鑷子，小毛筆，切片刀或一次性刀片，玻片等5.小鑷子，小毛筆，切片刀或一次性刀片，玻片等 • 小鑷子最好選用眼科用的彎小鑷子，這對於挾取微薄的切片較有用，如果用大鑷子很容易弄破切片，選用的毛筆以駝毛筆為好，因為這種筆柔軟，不易弄破切片。切片刀最好選用一次性刀片，這種刀片好處有不用磨，節省人力和物力；如果刀片出現缺口，可另更換刀口，直至丟棄，而大的切片刀就不可能這樣使用，如果刀有切口，就要將刀口磨去，磨去刀口是很費時的。
切片的步驟： 1、將蠟塊固定於切片機頭上的夾座內，調整到稍離開切片能夠切到的位置上 2、再調整蠟塊組織切面恰好與刀口接觸，旋緊刀架，固定好機頭。 3、根據需要調整切片厚度。 4、搖動切片機手輪先進行修整切片，直到切出完整的最大組織切面後，再進行切制。 5、操作中可用右手轉動切片機手輪，左手用毛筆托起蠟片，協調地進行切片操作。 6、用毛筆將切片帶從刀口向上挑起，拉下切片，然後輕拖鋪於恒溫水面上。
刀面角度 切割角度
切片的注意事項 1、切片品質的好壞，除與技術熟練程度和切片機的好壞有關外，切片刀是決定的因素，所以刀一定要磨得十分鋒利。否則在切片時會自行卷起或皺起，或將組織劃傷出現刀痕，更不能順利地將切片切成連續地長條帶狀。切片刀如有缺口存在，將使製成的切片斷裂、破碎，不完整，切片時應時時擦淨刀口。 2、切片機的各個零件和螺絲應旋緊，否則將會產生震動。在每次更換蠟塊時，應習慣地檢查一下組織塊是否夾緊，切片刀是否穩固，稍有疏忽就會影響切片品質，甚至將蠟塊全部切壞，造成不可彌補的後果。在切制切片的開頭階段如出現切制不良與其他故障，最常見的原因是蠟塊或切片刀的鬆動所致。
3、在搖動切片機時，用力要求均勻一致，不宜過重過猛，否則可因用力過重而使機身震動，造成切片厚薄不均。遇有硬化過度的腦、肝、脾等組織時，更應該輕輕切削，以防組織由於震動形成空洞現象。 4、在夏秋季節進行切片時，應使用冰塊加強冷卻，這樣不僅可保持石蠟的硬度，同時也減少了切片的褶皺，給切片製作帶來方便。
石蠟切片的異常及處理 • 一張理想佳良的切片，除組織固定適當和染色清晰之外，還應具備：薄、平整，無皺褶壓縮，無裂損抓跡及擦痕，同時貼片排列密集，整齊位置適當，透明度好，封片用膠適量，蓋玻片端正，無氣泡等。 • 異常狀況及處理方式 • 切片縱裂或縱斷 ：刀刃損，須磨。刀口粘附細絲維，須擦淨刀口。組織內有細小過硬異物或骨質等。剔除異物，骨質脫鈣。 • 切片彎曲或滾卷 ：刀鈍須磨。刀的傾角過大需調整 • 切片厚薄不均，寬窄相間，或在每張切片上有厚薄區帶 ：切片機調整螺旋須緊固。組織過硬，需用軟化劑處理，濕潤組織切面，稍冰凍，均勻而慢切。刀的傾角過大，須調整。
4.切制時組織破碎 ：刀鈍，須磨。蠟太軟，須用冰塊處理蠟塊切面。蠟內形成冰晶，凝固時冷卻得慢或含水及透明劑，須重新脫水。溫度過高使組織變硬變脆，先用溫水浸潤而後切。若有過多的膠質，則可浸入70%酒精甘油軟化後切片 。 5.組織壓縮，切片變窄，切片周圍蠟邊粘連使皺褶不易展開 ：蠟塊被壓縮，系由於刀刃斜面不平，須研磨刀。組織內纖維成分過多，細心處理組織。組織浸蠟不足，石蠟硬度不夠，室溫過高，低溫讓蠟塊硬度增強或選換硬蠟。
裱片 • 將漂浮於水面上的已展開沒有皺折的切片撈於載玻片上的過程稱為裱片或撈片。裱片時水溫很為關鍵，一般在45-55℃，如果水溫過高，超過石蠟的熔點，切片將會被熔化掉，如果水溫過低，在30度以下，切片則裱不好，皺皺巴巴，不能完成展片任務。 • 切片放入水後，在合適的水溫中它會自然展開，有個別沒有展開的，用小鑷子慢慢將其展開，鑷子的用力要恰到好處，如果用力過大，切片會被攪破，如果用力不對，切片無法展開。應特別注意。當切片展開後，用載玻片（有人喜歡用蛋白甘油塗於載片上，但據我們二十幾年對二十幾萬張活檢切片的經驗，沒有蛋白甘油塗片也能行）插入水中，靠近展開的切片撈於載玻片上，撈片時應儘量保持裱片器中的水不晃動。一張載玻片可以撈一張切片，也可以撈數張乃至十幾張，這要看組織的大小和病理的需要，一般說大的組織撈一張切片就已足夠，小的組織最好就要求多撈一些。
烘烤切片 切片的烘烤看似簡單，只在烘烤箱或乾燥箱一放，讓其烘烤就行了，但從某種意義上講，它也是一個關鍵，如果切片烘烤不好，到染色的時候，便會使切片脫離載玻片（掉片），使整個過程毀於一旦，因此，認真烤好切片是制好切片的前提。怎樣才能使切片烘烤得好呢？我們的做法如下：當切片裱於載玻片後，于烘烤箱邊豎立起來，擦幹水份，然後平放於烘烤箱的烤板上烘烤，溫度可調至70℃。當最後一個蠟塊切完後，前面的切片也烤得差不多了。
關於切片的烘烤，尤其是需做免疫組化切片的烘烤，要特別的注意對抗原的保存，使它們能在合適的烘烤切片時間內既不受到破壞，又能儘量地顯示出現，經多組多次的實驗認為，溫度和時間是極為重要的。溫度過高能使蛋白變性，抗原失活至喪失，時間過長，也會致使其失活和喪失。最初有人主張切片在60℃以下烘烤30-60min，然後進行染色，依此法進行實驗，結果切片脫片率高，切片鬆動的占100%，由於切片附貼不牢，染色時不敢用PBS充分沖洗，造成背影染色加深，鑒別特別困難。又由於脫片嚴重，重染次數增多，延誤了診斷，也造成人力物力的浪費。究竟什麼樣的溫度及時間才能做到既使切片附貼牢固，又不會對抗原造成影響的呢？經實驗證明：切片在60℃恒溫箱中連續烘烤3-5小時最為合適。這種時間和溫度烘烤出來的切片，可以用於抗原修復，PBS的沖洗，可滿足做免疫組化的一切需要。關於切片的烘烤，尤其是需做免疫組化切片的烘烤，要特別的注意對抗原的保存，使它們能在合適的烘烤切片時間內既不受到破壞，又能儘量地顯示出現，經多組多次的實驗認為，溫度和時間是極為重要的。溫度過高能使蛋白變性，抗原失活至喪失，時間過長，也會致使其失活和喪失。最初有人主張切片在60℃以下烘烤30-60min，然後進行染色，依此法進行實驗，結果切片脫片率高，切片鬆動的占100%，由於切片附貼不牢，染色時不敢用PBS充分沖洗，造成背影染色加深，鑒別特別困難。又由於脫片嚴重，重染次數增多，延誤了診斷，也造成人力物力的浪費。究竟什麼樣的溫度及時間才能做到既使切片附貼牢固，又不會對抗原造成影響的呢？經實驗證明：切片在60℃恒溫箱中連續烘烤3-5小時最為合適。這種時間和溫度烘烤出來的切片，可以用於抗原修復，PBS的沖洗，可滿足做免疫組化的一切需要。
切片的普通染色-HE stain • 通染色又稱常規染色或HE（Haematoxylin and eosin）染色。它是病理技術中最常用的一種方法，通過它可以做出病理診斷和發現尋求別的輔助方法，以達到準確，完整的病理診斷。一、染色目的病理學的所有切片，都必須通過一種以上的染料，通過各種不同的方法，將切片中各種不同的物質，在不同染液的作用下，將其顯示出來，使之在光學顯微鏡下，能夠完全的觀看各種結構。例如，HE染色，好品質的切片可以清晰地顯示出許多不同的結構，細胞核著藍黑色，細胞漿著粉紅色。清晰的結構為診斷提供可靠的依據。
二、染色的作用 1．化學作用：所有的染色液中，可把它們分為兩種類型，一種為酸性，另一種為鹼性。酸性染料中有染色作用的為陰離子；鹼性染料中有染色作用的為陽離子，每個細胞也存在著兩種物質，細胞核含的是酸性物質，細胞漿含的是鹼性物質。在染色時，細胞核中的酸性物質與蘇木素染液中的陽離子發生作用，細胞漿中的鹼性物質與伊紅染液中的陰離子發生作用，由於反應的部位不同，結果著色有異。2．物理作用：在染色過程中，染液中的色素微粒子浸入到被染組織的粒子間隙內，此時，因受分子的引力作用，色素微粒子被吸附而著色。由於各種組織有不同的吸附能力和不同的吸附程度，因此就可顯出來不同的顏色來。一般來說，染色的學說還有許多，但說服力強的僅有上述兩種。但不管怎麼樣解釋，實際上完成的每一種染色，都與上述兩種學說分不開，它們的作用是相輔相成，同時存在的。
染色時的注意事項： • 切片用二甲苯脫臘，應視不同的季節有不同的脫蠟時間，在夏天，室溫較高，脫蠟較迅速，往往在2-3min就可脫蠟乾淨，二在冬季，時間應相對延長。 • 切片在進入二甲苯前，可用電吹風吹切片，使切片上的蠟處於熔解狀態，這樣脫蠟較迅速，尤其是冬天，此法更可行。 • 切片上的蠟一定要清除徹底乾淨，否則將影響染色，造成切片染色不均的現象。
切片進行無水化處理，這一步驟，一是可增加切片的貼 附，二是可延長蘇木素的使用壽命。切片用二甲苯脫蠟後，不能直接水洗，因二甲苯不溶于水，必須經過酒精，酒精可溶解二甲苯，又能與水混合。切片用酒精將二甲苯徹底消除後，在進入蘇木素染液前，可用電吹風吹乾，這一步對於切片沒有充分的烤片時間，對於血塊等的切片來說，尤為重要，切片經此步驟，增加了附貼的牢固性，減少切片在染色過程中脫離載片的機會，保證了染色的成功率。另者，切片進入蘇木素染液全無水，可保證了蘇木素染液的濃度和PH值，延長其使用壽命。以往切片進入蘇木素染液前，都須經水洗，每次染色，都帶入不少的水分，稀釋了蘇木素染液的濃度，改變了它的PH值，使染液壽命縮短。
最後步驟:封蓋(mount) • 不含水封蓋法: • 所有石蠟切片均屬於此類，及標本必須脫水後才可封蓋 • 封蓋劑 (1)Entellan(Merk) ：最普遍使用之封蓋劑，透明無色，以xylene稀釋使用，揮發乾燥速度快故使用方便 (2)Canada Balsam：ㄧ種植物性膠，以xylene稀釋使用，經長時間保存會變為黃色，有礙外觀 (3)Permount：合成樹脂，略帶黃色，一為理想之封蓋劑。 (4)Bioleit:日本製，透明無色，久不變色，亦為理想之封蓋劑但價格較貴 (5)Histomount：透明無色，價廉
含水分的標本 使用在脂肪染色、crystal violet染色等，不可用酒精脫水，僅以濾紙輕輕吸取水份後，以水溶性封蓋劑封蓋。 • 封蓋劑 （1）甘油 （2）甘油明膠 （3）Apathy包埋介質:阿拉伯膠和水的混合物 （4）Thymol（麝香草腦)
其它方式包埋法 • Carbowax切片 • 碳蠟切片 碳蠟（Carbowax），學名聚乙烯二醇（Polyethlene glycol, PEG）為水溶性蠟。根據其分子量不同，碳蠟有多種，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用於組織包埋的有1500、4000兩種，其熔點分別38℃C和52。C左右，常溫下為固體石蠟狀，加溫熔化呈液體狀。 • 本法的特點是組織固定水洗後，不需脫水透明可直接浸蠟包埋，且切片方法與常規石蠟切片相同。切下的組織片漂浮水面後自然展開，碳虹迅速深化，組織片即可展平，製片過程簡單易行。
具體操作簡述如下：組織塊不宜過大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內。①組織固定後充分水洗去除固定液，用濾紙吸幹組織表面水。②將組織浸入碳蠟（1500）內，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液（1500和4000等量混合液），52℃30min。④浸入等量混合碳蠟液（或根據氣溫、濕度變化調整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合，反之，則2：3混合）。⑤用等量混合碳蠟或調整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過程中，碳蠟組織塊應儘量避免與水或冰接觸，貯存時應密封乾燥冷藏。具體操作簡述如下：組織塊不宜過大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以內。①組織固定後充分水洗去除固定液，用濾紙吸幹組織表面水。②將組織浸入碳蠟（1500）內，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蠟液（1500和4000等量混合液），52℃30min。④浸入等量混合碳蠟液（或根據氣溫、濕度變化調整4000和5000混合比例，如氣溫高濕度大可以4000：1500=3：2混合，反之，則2：3混合）。⑤用等量混合碳蠟或調整混合碳蠟包埋成組織蠟塊。⑥切片與石蠟切片相同。在操作過程中，碳蠟組織塊應儘量避免與水或冰接觸，貯存時應密封乾燥冷藏。 • 本法優點是操作程式減少，時間縮短，組織不經有機溶劑損害、溫度低、抗原性保存比石蠟切片好，組織結構清晰。缺點是夏季室溫高時切片較困難，連續切片不如石蠟切片順利；由於碳蠟有強吸濕性，不易長期保存。
塑膠切片 塑膠包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類（Glycol methacrylate, GMA）及環氧樹脂類（Epon 812,618），其優點是可以同時作光鏡和電鏡檢測，能相互對照所查抗原，定位準確。塑膠包埋切片可切出比石蠟切片更薄的切片，光鏡切片可薄至0.5～2um，故稱半薄切片（Semithin section）。GMA保存抗原較好，不與組織產生共聚合，但形態學結構欠佳。環氧樹脂如Fpon和Araldite能較好地保存形態學結構，但在聚合過程中易和組織起作用，改變抗原結構。塑膠包埋切片由於處理程式繁多，抗原活性易丟失。同時半薄切片進行免疫染色時，抗血清不易穿透樹脂，因此，塑膠切片主要用於免疫電鏡的超微切片前定位。包埋前染色的標本，切片薄切片後不需染色，直接在相差顯微鏡下觀察免疫反應部位呈黑點狀，定位後進一步作超薄切片，這樣，可以明顯提高免疫電鏡陽性檢出率。
火棉膠(Celloidin)組織切片製作技術在病理學科發展中起著重要的作用.特別是口腔的頜骨、胎兒頭顱,既有軟組織也有硬組織,組織之間軟硬度差別較大,組織塊體積較大,採用石蠟切片還達不到目的.而火棉膠包埋切片技術,能夠保持組織的完整性.火棉膠(Celloidin)組織切片製作技術在病理學科發展中起著重要的作用.特別是口腔的頜骨、胎兒頭顱,既有軟組織也有硬組織,組織之間軟硬度差別較大,組織塊體積較大,採用石蠟切片還達不到目的.而火棉膠包埋切片技術,能夠保持組織的完整性.
製作眼球切片，當以火棉膠包埋法為佳，但做活檢常規檢查時，用火棉膠包埋法不但費時甚久，而且切片過厚（10um），不能做細菌或其他特殊染色。因此不能滿足某些需要。若以普通之石蠟包埋切片，則眼球經二甲苯及浸蠟等處理，收縮過甚，而使視網膜有折卷脫位現象，切片亦破碎不整，各層次之間的聯繫紊亂。為防備此弊端起見，無論行火棉膠或是石蠟包埋，在開始固定時即非常注意。固定整個眼球，先在眼球旁開一個小窗，以Bouin液固定2～4天，火棉膠包埋則需要 10％福馬林固定。脫水應該從50％酒精開始，更換脫水劑時，避免直接用液體衝擊眼球，最好先將眼球取出，待溶液入瓶後，再輕輕將眼球放入瓶內。
celloidin包埋常用於大塊組織的包埋，可避免纖維組織和肌肉組織的過渡硬化，減少纖維組織的收縮和扭轉，利於保持原有組織結構，相對較費時，切片較厚，價格也較貴。一般過程如下：1. 組織塊經過固定（時間根據組織類型確定，眼球一般固定12～24h，氣溫低時適當延長）水洗後入50％和60％酒精各6～12h。2. 70％、80％和90％酒精各6～24h。3. 95％和100％酒精各12～24h。4. 乙醚和100％酒精等量混合液24h。5.2％火棉膠液（2g火棉膠，50ml乙醚，50ml純酒精）24～48h。6. 4％火棉膠液（4g火棉膠，50ml乙醚，50ml純酒精）24h至數周。7. 8％火棉膠液（8g火棉膠，50ml乙醚，50ml純酒精）24h至數周，使其浸透飽和。 8.16％火棉膠液（16g火棉膠，50ml乙醚，50ml純酒精）一周。9.用足量16％或30％火棉膠液倒入平底玻璃器皿，組織平放，埋於其中，用蓋遮擋並略留出縫隙，使其緩慢蒸發，用手指輕壓火棉膠不出現指紋時硬度即可。注意揮發過快膠內會產生氣泡。10.倒入2倍氯仿使其硬化12～24h。11.修去組織周圍多餘的火棉膠，浸入濃度為80％的酒精中硬化6h。12.將膠塊底面和木快同時浸入乙醚、酒精混合液，稍溶後，加少許膠，使膠塊和木快粘合，待乙醚、酒精揮發後放入濃度為80％的酒精液中使其硬化，即可切片，包埋好後的組織塊可存放人濃度為70％的酒精液內。
火棉膠切片法：刀片鋒利，一般切片厚度大於或等於10um，切好的膠片應先放在濃度為70％或80％的酒精液中，而不立即貼在載玻片上，餘下的膠塊也應保存在濃度為70％的酒精液中，防止火棉膠繼續揮發影響硬度火棉膠切片法：刀片鋒利，一般切片厚度大於或等於10um，切好的膠片應先放在濃度為70％或80％的酒精液中，而不立即貼在載玻片上，餘下的膠塊也應保存在濃度為70％的酒精液中，防止火棉膠繼續揮發影響硬度
