xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication
Download
Skip this Video
Download Presentation
XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 56

XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication - PowerPoint PPT Presentation


  • 55 Views
  • Uploaded on

XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication. Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I. Nicolas Lévy 22 novembre 2007.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication' - hafwen


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
xrcc1 un l ment clef de la r paration des l sions de l adn coupl e la r plication

XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de l’ADN couplée à la réplication

Thèse présentée pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I

Nicolas Lévy

22 novembre 2007

Thèse réalisée au sein du département Intégrité Du Génome de l’ UMR 7175, ESBS, sous la direction de Josiane et Gilbert de Murcia

Dessin de N.Bouvier pour G.Almouzni

slide2

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
  • Introduction :
    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide3

Les différents types de lésions de l’ADN

Réactions spontannées

Agents alkylants

Radicaux oxygénés

Rayons X

Rayons UV

Rayons X

Radiomimétiques

Erreurs de

la réplication

Modification de base:

Désamination spontanée,

Alkylation, Oxydation

Dimère de

thymine

Site

abasique

Cassure

simple-brin

(SSB)

Cassure

double-brin

(DSB)

Nucléotides

mésappariés

G

T

DSBR:

NHEJ

HR

NER

MMR

BER

SSBR

Adapté de D.M.Wilson III et al., Encyclopedia of RespiratoryMedicine, Ed. Elsevier, 2005

slide4

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide5

5\'

P

OH

5\'

FEN1

PARP-1

PNK

Polß

PARP-2

Polß

Réparation des cassures simple-brin de l’ADN (SSBR)

• Reconnaissance de la base endommagée

APE1

XRCC1

P

OH

• Reconnaissance de la cassure simple-brin (SSB)

PARP-1

5\'

P

OH

5\'

• Recrutement de XRCC1 assemblage du complexe de réparation

XRCC1

Lig3

g-Rays, ROS...

OH

P

PNK

• Traitement des extrémités de la lésion

XRCC1

Lig3

PARP-1

• Remplissage de la brèche

PARP-2

Lig3

XRCC1

Lig3

XRCC1

• Ligation des extrémités de la lésion

Adapté de Whitehouse et al. (2001) Cell 104, 107-117

slide6

LA famille PARP

Schreiber et al., Nature Reviews, 2006

slide7

La réaction de poly(ADP-ribosyl)ation

Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006

PARP-1

Poly(ADP-ribose)

(PAR)

ADN

slide8

Les rôles de la poly(ADP-ribosyl)ation

PARylation des histones

Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006

slide9

X-ray Repair Cross Complementing group 1, XRCC1

  • Protéine sans activité enzymatique : rôle de plateforme d’interaction et d’organisation
  • Deux domaines homologues à l’extrémité C-terminale de BRCA1 (BRCT)
  • Recrutée en quelques secondes au niveau des coupures de l’ADN sur le PAR synthétisé par PARP-1

Recrutement de XRCC1 au niveau des lésions de l’ADN

Anti-PAR Anti-XRCC1 DAPI + merge

slide10

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide11

Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR)

  • Cassures double-brin de l’ADN (DSB):
  • Hautement toxiques pour la cellule : pertes de fragments de chromosomes, translocations...
  • Directes (rayonnements ionisants, drogues radiomimétiques)
  • Indirectes (réplication d’un ADN endommagé)
  • Deux voies de réparation des DSB:
  • Recombinaison homologue (RH) : phases S tardive et G2 du cycle cellulaire
  • Recombinaison non homologue (NHEJ) : tout au long du cycle cellulaire

HR

NHEJ

Rothkam et al., Mol. Cel. Biol., 2003

slide12

Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR) par NHEJ

Ku70/Ku80

• Reconnaissance du DSB par Ku70/Ku80, sous-unités de DNA-PK

DNA-PKcs

DNA-PK

• Fixation de DNA-PKcs, assemblage de l’holoenzyme DNA-PK

• Alignement des deux extrémités de la lésion

• Ligation finale des deux extrémités de la cassure double-brin

LigIV/XRCC4/XLF

Helleday et al., DNA Repair, 2007

slide13

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide14

Réplication de l’ADN

  • Duplication fidèle du matériel génétique de la cellule avant sa division
  • Deux étapes principales : initiation et élongation
  • Initiation : synthèse d’un oligonucléotide ARN/ADN servant d’amorce aux ADN polymérases réplicatives
  • Elongation : recrutement de l’anneau de processivité PCNA et des ADN polymérase réplicatives hautement fidèles et processives

Brin discontinu

Initiation

Brin continu

Elongation

slide15

Le complexe ADN polymérase a-primase

  • Complexetetramérique chargé de la synthèse des amorcesd’ARN/ADN nécessaires à l’initiation de la réplication et à la synthèse des fragments d’Okazaki
  • L’ADN primase p48-p58 synthétise la portion ARN des amorces
  • L’ADN polymérase a synthétise la portion ADN des amorces
  • L’ADN primase agit comme frein moléculaire au cours de la réplication de l’ADN (Jong-Bong Lee et al., Nature 439, 621-624)
  • p58 est la sous-unité régulatrice de l’ADN primase eucaryote

Arezi et al., TIBS, 2000

slide16

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide17

Un rôle pour XRCC1 dans le coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

  • Les cellules EM9 déficientes en XRCC1 présentent 12x plus d’échanges de chromatides sœurs (SCE) que les cellules sauvages (Dillehay et al., Mutat. Res., 1983)
  • La mutation du domaine BRCT1 entraîne une diminution de la survie des cellules après traitement au MMS (Taylor et al., Mol. Cell. Biol., 2002)
  • La mutation du domaine BRCT1 entraîne un défaut de redémarrage de la synthèse d’ADN après traitement au MMS (Kubota et al., Nucl. Acids Res., 2003)
  • XRCC1 interagit avec l’anneau de processivité PCNA et colocalise avec cette protéine au niveau des foyers de réplication (Fan et al., Nucl. Acids Res., 2004)
  • Les cellules traitées par ARN interférence dirigé contre XRCC1 s’accumulent en phase S 24h après traitement au MMS (Brem et al., Nucl. Acids Res., 2005)
slide18

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide19

Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

  • Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli
  • Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose
  • Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa
  • Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés
  • Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse

GST-

BRCT1

GST

DNA-PKcs

PARP-1

p58

Dimère

de GST

GST-BRCT1

PCNA

GST

slide20

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide21

XRCC1 et p58 interagissent in vitro

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

c

GST-XRCC1

d

GST a b c d e WB

e

XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase après traitement à l’hydroxyurée

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est suffisant pour l’interaction avec p58

slide22

XRCC1 interagit avec la moitié N-terminale de p58

XRCC1

p58

N

C

NLS

1 6 12 G266 509

Amido black

Far western blot Anti-XRCC1

slide23

XRCC1 et p58 interagissent in vivo

-HU +HU

DAPI+Merge XRCC1 p58

XRCC1 et p58 colocalisent dans les foyers de réplication des cellules traitées par hydroxyurée

slide24

Le poly(ADP-ribose) et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58

par sa moitié N-ter

p58 lie le PAR

Test de mobilité électrophorétique:

Le PAR et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58

Le PAR inhibe la liaison de p58 à

l’ADN substrat

slide25

La fixation de PAR par p58 inhibe l’activité primase de p48-p58 in vitro

Influence du PAR sur l’activité primase

La liaison du PAR à p58 inhibe fortement l’activité primase du complexe p48-p58

slide26

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux élevés de PAR

DAPI GFP-BRCT1 Anti-PAR Colocalisation

+H2O2 Contrôle

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent une forte automodification de PARP-1 et une forte hétéromodification de XRCC1 au niveau de son domaine BRCT1

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux significatifs de PAR nucléaire en absence de traitement, et des niveaux très élevés de PAR après endommagement de l’ADN

slide27

XRCC1 est nécessaire à la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

2n 4n 2n 4n

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 perturbe fortement la progression des cellules à travers le cycle cellulaire, après traitement au MNU

slide28

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 inhibe la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 entraîne une accumulation des cellules en début de phase S : la réplication est inhibée, ralentie

slide29

Microinjection,

Extraits d’œufs ,

Réplication in vitro

Le modèle Xenopus laevis

  • Xenopus laevis:
  • Allotétraploïde
  • 36 chromosomes
  • 20-22°c température optimale de croissance
  • ♀11cm /♂6cm
  • œufs 1,2-1,3 mm Ø
  • 1000 à 6000 œufs/ponte
  • temps de génération
  • >2 ans
slide30

Extraits d’oeufs de xénope

Formation d’une

Membrane nucléaire

Cycle unique et complet de réplication de l’ADN

ADN

matrice

Addition de protéines recombinantes (BRCT1 / BRCT2)

Système acellulaire :

Immunodeplétion (anticorps anti-XRCC1)

Traitement de la chromatine par des agents génotoxiques

Utilisation d’inhibiteurs PARP/PARG

Réplication de l’ADN dans les extraits d’œufs de xénope

  • Analyse des cinétiques de réplication
  • Analyse des protéines (WB, IF)
  • Analyse de la taille des ADN synthétisés
slide31

Xenopus egg

extracts

HeLa cells

@XRCC1

Pc souris A

Xenopus egg

extracts

HeLa cells

@PARP1

Pc souris EGT69

XRCC1 est une protéine fortement conservée au cours de l’évolution

~ 80% d’homologie de séquence entre la protéine humain et celle de xénope

> 90% d’identité de séquence au niveau du domaine BRCT1

slide32

X.l. XRCC1 BRCT1 ralentit la réplication des ADN endommagés

Tailles des ADN répliqués

Analyse des cinétiques de réplication de l’ADN

Chromatine non traitée

Chromatine traitée MMS

Analyse de la taille des ADN répliqués sur gel alcalin

L’addition de GST-BRCT1 recombinant dans les extraits d’œufs de xénope freine la réplication des ADN endommagés

slide33

X.l. XRCC1 BRCT1 bloque l’initiation de la réplication des ADN endommagés

Accumulation de complexes de pré-initiation

Défaut d’association de PCNA sur la chromatine

 Inhibition de l’initiation de la réplication

slide34

L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par XRCC1 BRCT1 est dépendant de sa PARylation

+ GST

+ GST-BRCT1

+ inhibiteur PARP KU0058948

+GST-BRCT1

Analyse des cinétiques de réplication de la chromatine endommagée au MMS

L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par le domaine BRCT1 de XRCC1 dépend de sa modification par PARP-1

slide35

Modèle : XRCC1 interagit avec p58 pour freiner la réplication des ADN endommagés afin de préserver l’intégrité du génome

slide36

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide37

Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

  • Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli
  • Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose
  • Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa
  • Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés
  • Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse

GST-

BRCT1

GST

DNA-PKcs

PARP-1

p58

Dimère

de GST

GST-BRCT1

PCNA

GST

slide38

DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

c

GST a b c d e

GST-XRCC1

d

e

Far western blot

Anti-XRCC1

XRCC1 interagit avec les 3 sous-unités de DNA-PK

DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1

slide39

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK sur son domaine BRCT1 en réponse aux rayons ionisants

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

GST a b c d e

c

GST-XRCC1

d

e

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vivo par DNA-PK en réponse aux rayonnements ionisants

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vitro par DNA-PK

slide40

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371

DNA-PK

S371

Un seul motif potentiel de phosphorylation par DNA-PK de type SQ au sein du domaine BRCT1 de XRCC1 : SQ 371/372

La sérine 371 de XRCC1 constitue le site de phosphorylation par DNA-PK

slide41

XRCC1

XRCC1 dimérise via son domaine BRCT1 et la phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1

a

1-170

170-428

282-428

314-428

427-633

b

c

GST-XRCC1

La phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1

d

e

DNA-PK

P

P

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est une interface de dimérisation

XRCC1

XRCC1

BRCT1

BRCT1

slide42

P53

P

S15

GST

Le dimère XRCC1 stimule l’activité kinase de DNA-PK in vitro

XRCC1 stimule fortement l’activité kinase de DNA-PK

C’est la forme dimère de XRCC1 qui possède cette capacité à stimuler DNA-PK

slide43

Le mutant S371L de XRCC1 entraîne la persistance de cassures double-brin de l’ADN

EM9

XRCC1 wt

EM9 XRCC1

S371L

EM9

(Déficientes en XRCC1)

NT

1Gy/1H

Immunofluorescence: anti-gH2AX

Foyers gH2AX = sites de cassures double-brin de l’ADN

Le mutant non phosphorylable S371L de XRCC1 entraîne une persistance des DBS alors qu’il est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK

Le dimère XRCC1 est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK, mais sa dissociation est importante pour la suite du mécanisme de réparation des DSB

slide45

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide46

XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 du complexe ADN polymérase a-primase pour freiner la réplication des ADN endommagés

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK et stimule l’activité de cette kinase pour favoriser la réparation des DSB générés lors de la réplication de l’ADN

PARP-1 interagit avec l’ADN polymérase a et inhibe son activité en l’hétéromodifiant

(Eki et al., FEBS Letters , 1994; Simbulan-Rosenthal et al., Biochemistry, 1996; Dantzer et al., Nucl. Acids Res., 1998)

PARP-1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité kinase en l’hétéromodifiant

(Ruscetti et al., J. Biol. Chem., 1998)

XRCC1 et PARP-1 forment un couple étroitement lié et agissent de façon synergique pour inhiber la réplication des ADN endommagés et pour organiser la transition entre SSBR et DSBR

slide48

Introduction :

    • Les différents types de lésions de l’ADN
    • La réparation des cassures simple-brin de l’ADN : PARP-1 et XRCC1
    • La réparation des cassures double-brin de l’ADN : le NHEJ
    • La réplication de l’ADN : le complexe Pol a-primase
    • Un rôle pour XRCC1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
  • Résultats :
    • Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
    • XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase pour freiner la réplication des ADN endommagés
    • XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK en réponse aux dommages dans l’ADN
  • Discussion et perspectives :
    • XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
    • XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
slide49

XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

Chimiothérapies, radiothérapies : endommagement de l’ADN de cellules tumorales pour provoquer leur mort.

Limites : effets secondaires sur les cellules saines de l’organisme, résistance des tumeurs

Inhibition des voies de réparation de l’ADN : potentialisation des traitements anticancéreux

Inhibiteurs PARP : potentialisation des traitements par irradiation

effet important sur les tumeurs liées à BRCA1/2

Bryant et al., Nature, 2005

G. Noël et al., Mol. Cancer Ther., 2006

slide50

XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

Inhibition des fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 : perturbation de la prise en charges de lésions au cours de la réplication ainsi que du NHEJ

Aptamère (court oligonucléotide à structure tridimensionnelle complexe) :

Forte affinité pour une cible protéique spécifique

Inhibition des fonctions de la cible liée

Peptide inhibiteur, se liant en dominant négatif au domaine BRCT1 de XRCC1 et empêchant les interactions protéiques normalement assurées par ce domaine

  • Accumulation importante de lésions dans l’ADN
  • Ciblage spécifique des cellules tumorales en prolifération
slide51

DEPARTEMENT “INTEGRITE DU GENOME” DE l’UMR 7175

ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG UNIVERSITE LOUIS PASTEUR

LRC-CEA n° 39boulevard Sébastien Brant, BP 10413

F-67412 IllkirchCedex, France

Un grand merci :

A tout le département « Intégrité Du Génome » de l’ESBS :

Au jury :

Directeur de thèse : Dr. Gilbert de Murcia

Rapporteur interne : Pr. Philippe Carbon

Rapporteur externe : Dr. Janet Hall

Rapporteur externe : Dr. Pablo Radicella

Examinateur : Dr. Domenico Maiorano

Invitée : Dr. Anne Bresson

Au Dr. Marcel Méchali et à tout le laboratoire « Surveillance et Stabilité du Génome » de l’Institut de Génétique Humaine de Montpellier

A Josiane Ménissier de Murcia, Directrice de thèse

Laboratoire de

recherche

associé n° 39V

http://parplink.u-strasbg.fr

slide54

Activité spécifique : Sa = (CPMi x Fd)/(CdATPxV) (cpm/pmol dATP)

Quantité de dATP incorporée : ndATP = (CPM x Fd)/Sa (pmol)

Masse des nucléotides incorporés : m = ndATP x 4 x 0,33 (ngr)

Pourcentage d’ADN répliqué = m / mchromatin

slide56

Perspectives

Conclusions

La réplication de l’ADN est inhibée par l’interaction entre le domaine BRCT1 (PAR)ylé de XRCC1 et la sous-unité p58 de l’ADN primase, en réponse au stress génotoxique, afin de maintenir l’intégrité du génome (évite les collisions entre les fourches de réplication et les SSB non réparés, susceptibles de générer des DSB hautement toxiques)

Arrêt de la réplication par inhibition de l’ ADN primase par le ppGpp en response stress nutritionel (Wang et al. Cell 128, 865-875)

Stabilisation de la machinerie réplicative sur un ADN endommagé grâce à l’ATP généré lors de la dégradation du PAR (Maruta et al. Biol. Pharm. Bull. 30, 447-450)

Etude dans un modèle déficient pour XRCC1 (cellules EM9, extraits d’oeufs de xénope déplétés pour XRCC1…)

Etude de la réplication sur un substrat synthétique avec des lésions localisées

ad