Лазерната микродисекция- безценният инструмент на
Download
1 / 81

Център по молекулна медицина - PowerPoint PPT Presentation


  • 154 Views
  • Uploaded on

Лазерната микродисекция- безценният инструмент на молекулярната патология и диагностика, съдебната медицина и съвременната наука. Център по молекулна медицина. Нова биомедицинска революция.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Център по молекулна медицина' - hadar


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

Лазерната микродисекция- безценният инструмент на молекулярната патология и диагностика, съдебната медицина и съвременната наука

Център по молекулна медицина


Нова биомедицинска революция безценният инструмент на


Предизвикателството пред патологията е да интегрира клиничните, морфологичните и молекулярните измерения на заболяванията


От молекулярната биология до патологията и медицината: важността на тъканните биологични проби

  • Тъканите показват морфолигичната природа на заболяването

  • Откриването и характеризирането на молекулните механизми на заболяването

  • Валидиране на нови потенциални биомаркери

  • Архив

  • Предизвикателство: събирането на проби, етичност, процесиране (стабилност на биомолекулите), комплексност


..................... патологията и медицината: важността на тъканните биологични пробитъканите са комплексни


В близост до тумора има разнообразни клетъчни субпопулации


Защо тъкани? разнообразни клетъчни субпопулации

  • Култивирани клетъчни линии

    • Предимства: самореплициращи се, дават добър добив ДНК, РНК и белтъци

    • Недостатъци: отнема време да се създадат, скъпо е, не винаги е успешно създаването им. Въпреки че клетъчните линии носят генетичните промени в тумора, от който произлизат, допълнителни промени възникват по време на последователните пасажи или само определени туморни клетки (например агресивни) се размножават. Генната експресия в култивираните клетки може да е много различна от тази на тумора, защото те вече не са под контрола на тъканни елементи


Защо тъкани? разнообразни клетъчни субпопулации

  • Ксенографтно обогатяване на клетъчните култури- същите ограничения

  • Техники за сортиране на клетки- плътностни градиенти, флуоресцентно активирано клетъчно сортиране, антитяло-белязани имуно частички и афинитетно-белязани магнитни частички. Необходимо е обаче да се направи суспензия от клетки.


Развитието на микродисекцията разнообразни клетъчни субпопулации

  • Микродисекция е била използвана много преди изобретяването на LM (лазерна микродисекция)

    • Lowry and Passonneau- използвали лиофилизирани тъканни срези

    • Goelz et al- използвали парафинови блокчета


Недостатъци на ръчните методи на микродисекция

  • Изисква се голяма сръчност

  • Въздушните течения могат да доведат до загуба на микродисектирания материал при преноса от пипета или много тънко типче в центрофужна епруветка

  • Риск от контаминация

  • Трудност в изолирането на дифузно разположени клетки

  • Времеемки

В опит да се подобри ръчното изолиране било въведено използването на тиксо, което да покрива избраната за микродисектиране област от въздушни течения и тремор на ръката на оператора


Развитието на лазерната микродисекция (LM)

  • Meier-Ruge et al- 1976, инициират развитието на LM като използват примитивна UV лазерна технология, която заема голямо пространство, но постигат микродисекция на клетъчни субпопулации от хетерогенни тъкани по-точно от всички ръчни методи

  • Shibata- 1993-UV лъч, който да разрушава ДНК на нежеланите компоненти от тъканта (Selective ablation of unwanted regions)

  • Emmert-Buck et al- 1996 в NIH- Arcturus Engineering


LM микродисекция (разкрива нови възможности

  • Молекулярни анализи

  • Онкология/ Патология

  • Изследване на единични клетки

  • Цитогенетка

  • Живи клетки от клетъчни култири

  • Изследвания на мозъка

  • Криминология

  • Ембриология


LCM микродисекция (на определена хипоталамусна област


Видове микродисекция (LM

  • IR LCM- инфрачервеният лазерен пулс води до локално топене на EVA полимер, адхезиране на клетките към стопената мембрана. При охлаждане мембраната отново се втърдява и клетките се отделят от нея

  • UV LM-фотоизпарение на нежеланата тъкан, обграждаща желаната област чрез много тесен лазерен лъч

  • Комбиниращи IR и UV- Arcturus Veritas и Acturus XT


Ir lcm
Принцип на микродисекция (IR-LCM


Преди микродисекция (LCM

След LCM

LCM филм


Ir lcm1
Апарати осъществяващи микродисекция (IR LCM

  • Arcturus/MDS, Inc

    • PixCell II

    • AutoPix


Arcturus PixCell II микродисекция (


Arcturus AutoPix микродисекция (


Uv lm
UV LM микродисекция (


Uv lm1
UV микродисекция ( базирани системи за LM

  • Laser Microdissection (LMD/Leica)

  • Cut and catapulting system (PALM/Zeiss)

  • Mmi-CellCut (MMI AG)


LMD/Leica микродисекция (


PALM/Zeiss микродисекция (


Mmi-CellCut (MMI AG) микродисекция (


Смесен тип микродисекция (LM

  • Съчетават UV и IR в един апарат:

    • Arcturus Veritas

    • Acturus XT


Arcturus Veritas микродисекция (

Acturus XT


Eppendorf ppmd microdissector
Алтернатива на лазерната микродисекция: Eppendorf PPMD microdissector

По- евтин, но с по-ниска прецизност и точност


Характеристики на най-често използваните техники за микродисекция


Видове проби и изисквания към пробите

  • Чрез LM могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозоми


Видове проби и изисквания към пробите

  • Чрез LM могат да се микродисектират отделни клетки, клетъчни области, хромозоми или дори части от хромозоми

  • Пробите могат да са FFPE, замразени тъкани и цитологични препарати

  • Факторите въздействащи на интегритета на биомолекулите са: начин и тип съхранение на пробите, времето за съхранение преди микродисекцията, метода за фиксация и метода на микродисекция


Очакван добив след лазерна микродисекция

  • 1 клетка = 6-7 pg геномна ДНК

  • 1 клетка = 10-30 pg тотална РНК

    • 80-85% rRNA

    • 15-20% tRNA, snRNA

    • 1-5% mRNA

  • Белтъчното съдържание зависи от типа органи и от степента на белтъчна деградация


Предимства на лазерната микродисекция

  • Бързина (особено UV LM), прецизност, гъвкавост и възможност за документиране на експериментите

  • Избягват се сложните стъпки, осъществявани от оператора

  • Не разрушава съседни тъкани

  • Могат да се изолират клетки разпръснати сред други клетъчни популации

  • Приложение в молекулната генетична диагностика

  • При UV системите за разлика от IR системите няма контакт с тъканта, няма риск от контаминация


Ограничения на лазерната микродисекция

  • Намалена оптична резолюция на оцветените и дехидратирани тъканни срези поради липсата на предметно стъкло

  • Трудности при прецизното микродисектиране на комплексни тъкани с ограничени архитектурни характеристики (лимфоидни неоплазии, дифузно инфилтрирани карциноми).

    • Специални багрила или имунохистохимично оцветяване

    • Използване на дифюзер


Ограничения на лазерната микродисекция

  • При contact-lift off метода често има затруднения в събирането на избраните клетки от препарата, което може да се дължи на здраво прикрепяне на тъканта към положително заредено предметно стъкло или на остатъчна влага останала в тъканта

  • При FFPE препаратите наличие на повреди в ДНК, РНК и белтъците => ограничения в PCR базираните методи за изследване- трябва да се амплифицират къси ампликони

  • IR LCM не са добри за дисектиране от срези по-тънки от 10µm


Предизвикателства пред микродисекцияLM

  • Всички микродисекционни системи са микроскоп базирани:

    • Оператор-зависими

    • Хистопатологично обучение е необходимо

  • Процесивност

    • Събирането на голям брой клетки за някои видове анализи понякога е невъзможно

  • Не винаги са подходящи за много малки мишени

    • Отделни клетки или разпръснати клетки, субклетъчна микродисекция


Хирургични срези микродисекция

Цитологични препарати

Touch Prep

Клетъчен блок

Thin Prep

Cyto Spin

ИХХ оцветени

Замразени

В парафин

FISH

Смир

Стабилизиране на пробите

Подготовка на микроскопските препарати

LM

Изолиране

Анализи

Източници на биологичен материал


Приложения на микродисекцияLM

  • ДНК базирани анализи

  • РНК базирани анализи

  • Протеин базирани анализи

  • микроРНК базирна анализи

Откриване на нови биомаркери

Диагноза

Прогноза

Таргетна терапия


ДНК базирани анализи микродисекция

  • LOH


ДНК базирани изследвания- микродисекцияLOH

  • LOH анализите при изследване на рак се използва за картиране на туморсупресорни гени и за изучаване честотата на промяна на определени туморсупресори при различни видове тумори

  • LOH за анализ на клоналността:

    • Анализ на клоналността на мултифокалните тумори

    • Клонален анализ на първичните и метастазиралите тумори

    • Клонален анализ на прогениторни клетки в мултикомпонентни тумори


ДНК базирани изследвания- клонален анализ на X свързаното алелспецифично хиперметилиране

  • Клетките получени от една прогениторна клетка имат инактивиране на една съща Х хромозома

  • За доказване на клонална неопластична трансформация


РНК базирани анализи клонален анализ на

  • Изследване на експресионен профил

  • Серийни анализи на генната експресия

  • Микрочипове


Протеомика клонален анализ на

  • Western Blot

  • 2D-PAGE

  • Зимограми

  • Обратно фазови чипове

  • Мас спектроскопски техники


Примери за приложението на клонален анализ на LM


Възникване на рака на стомаха клонален анализ на


Изолиране на клонален анализ на inner cell mass cells (белите стрелки)

Трофектодермални клетки (черни стрелки)


LCM клонален анализ на на ендосперм


LCM клонален анализ на на крио срези на глобуларната фаза на Arabidopsis

embryo


LCM клонален анализ на за изучаването на молекулните промени при меланома


Простатна тъкан преди клонален анализ на LCM

LCM туморен епител

LCM тумор асоциирана строма

Простатна тъкан преди LCM

LCM нормален епител

LCM нормална строма


Приложението на клонален анализ на LM в криминалистиката

  • STR анализите- основен метод за ДНК базирана идентификация

    • Повечето следи съдържат клетки от повече от един източник => изолиране на ДНК от повече от един индивид -> микс от генотипи и трудно интерпретиране на резултатите

    • Често клетките на жертвата са много повече от клетките на извършителя



Недостатъци на разработените методи за разделяне на сперматозоиди от други клетки

  • Диференциален лизис метод- за разделяне на спермата от епителните клетки

    • Получават се две фракции (ДНК от извършителя и ДНК от жертвата), но разделянето НЕ винаги е пълно

  • У- хромозомен STR анализ

    • У хромизомите са идентични при всички роднини по бащина линия


Недостатъци на разработените методи за разделяне на сперматозоиди от други клетки

  • Филтрационен метод

    • 70% от сперматозоидите преминават през филтъра, а епителните клетки остават на повърхността

    • 1-2% от епителните клетки също успяват да преминат през филтъра

  • Флуоресцентно активарано клетъчно сортиране

    • Прилага се единствено за вагинални лаважи. НЕ може да се прилага за вагинални натривки или архивен материал, нито за разделяне в тъканни препарати


Недостатъци на разработените методи за разделяне на сперматозоиди от други клетки

  • Магнетично активирано клетъчно сортиране

    • Трудно се открива моноклонално антитяло специфично свързващо антиген на повърхността на сперматозоидите

    • Антитен стабилен в деградирали съдебни проби

  • Микро изфабрикувано устройство за разделяне на сперматозоиди от епителни клетки на Horsman et al- базира се на различни физични свойства на клетките

    • Само 25% от сперматозоидите се възстановяват (остават интактни)


Всички тези методи са неефикасни при сепарацията, при използването на минимално количество материал или невъзможност за използването на архивен материал

За да се направи пълен ДНК профил са необходими 15-20 интактни сперматозоида, които могат да бъдат осигурени чрез LM.


Разработващи се методи при сепарацията, при използването на минимално количество материал или невъзможност за използването на архивен материал

  • Изолиране и на други мъжки клетки- добра алтернатива при азооспермените извършители

    • Полово специфично белязане на келтки за LCM- FISH- У хромозомни специфични проби

  • Изолиране на женски клетки (от кондоми)

    • Белязана на Х и У хромозомите с различни флуоресцентни багрила


Приложения при сепарацията, при използването на минимално количество материал или невъзможност за използването на архивен материална LM в криминалистиката

  • Събиране на фоликули от косми с цел по-ефикасно изолиране на ДНК без контаминиращи вещества (инхибитори като кератин)

  • Изолиране на кръвни клетки от различни клетъчни смеси- например от кръв и слюнка

  • LCM за получаване на ДНК профили от биологични проби, когато са смесени с отломки, замърсители, прах, мръсотия

    • Изолиране на клетки от букална лигавица смесени с почва


Приложения при сепарацията, при използването на минимално количество материал или невъзможност за използването на архивен материална LM в криминалистиката

  • Отделяне на клетки от лепенки, използвани за събиранее на улики от коли, трупове и др.


Lm expression microdissection xmd automated cell recognition
Бъдещето на при сепарацията, при използването на минимално количество материал или невъзможност за използването на архивен материалLM- Expression Microdissection (xMD), Automated Cell Recognition

  • Имуно-базирана микродисекционна технология за бърза, специфична и полу-автоматична тъканна микродисекция


  • Не е необходима микроскопска идентификация на таргетните клетки

    • Срезите са ИХХ белязани. Препарата се покрива с термочувствителен филм, следва облъчване на цялото и поле и накрая филмът се отделя със захванатите таргетни клетки

  • Процесират се около 50 000 клетки за секунда

  • Елиминират се трудностите при селекцията на таргетни клетки поради не добрата картина

  • Оператор- независима система


Благодаря за вниманието ! идентификация на таргетните клетки


Благодаря за вниманието ! идентификация на таргетните клетки


ad