Transkrypcja genów jądrowych u roślin i jej regulacja

1. Transkrypcja genów jądrowych u roślin i jej regulacja

2. Maszyneria transkrypcyjna - prokarionty • Mechanizmy regulacji ekspresji genów różnią się zasadniczo u eukariontów i prokariontów. • U prokariontów stan podstawowy dla transkrypcji jest nierestrykcyjny (brak ograniczenia dostępności do DNA dla kompleksu RNA polimerazy). Negatywna regulacja jest rzadka i zależy od represorów specyficznych dla konkretnych sekwencji. • U prokariontów sieć regulatorowa genów ma niską złożoność. Pojedynczy TF reguluje średnio 3 geny, a pojedynczy gen jest pod kontrolą średnio dwóch TF. Wiele promotorów regulowanych jest przez pojedynczy regulator. Regulatory te rzadko regulują transkrypcję innych TF. • U prokariontów, wiążące się z DNA, specyficzne sekwencyjnie TF na ogół rozpoznają długie sekwencje (>12 par zasad).

3. Maszyneria transkrypcyjna - eukarionty • U eukariontów stan podstawowy dla transkrypcji jest restrykcyjny, co wynika z upakowania DNA w chromatynę, która uniemożliwia rozpoznawania standardowych promotorów przez podstawową maszynerie transkrypcyjną. • Wpływ struktury chromatynowej promotora na jego dostępność czyni niezbędnym udział w regulacji transkrypcji czynników modyfikujących chromatynę. Określa to w zasadniczy sposób model regulacji transkrypcji u eukariontów. W systemie regulacji uczestniczą nie tylko składniki podstawowej maszynerii transkrypcyjnej i wielka liczba TF wiążących się ze specyficznymi sekwencjami DNA, ale także bardzo liczne i rozmaite białka związane z chromatyną. • U eukariontów regulatory transkrypcji działają według logiki kombinatorycznej, co skutecznie zwiększa liczbę i różnorodność aktywności regulatorowych i prowadzi do dużej złożoności sieci regulacyjnych. Sekwencje rozpoznawane przez eukariotyczne TF mają długość 5-10 par zasad.

4. Polimerazy RNA u eu- i prokariontów • Pro: podjednostki 2Xalfa, β, β’, ω (omega) (Holoenzym ca. 500 000 D) • Eu: 12 podjednostek (Holoenzym ca. 550 000 D)

5. Promotor prokariotyczny • Obejmuje dwie podstawowe sekwencje zaangażowane w kontrolę transkrypcji: TATAAT (-10 pz) i TTGACA (-35 pz)

6. Inicjacja transkrypcji u prokariontów • Polimeraza RNA wiąże się do DNA i przesuwa się po nim aż do odnalezienia promotora • Podjednostka sigma rozpoznaje sekwencję -35 pz i powoduje ścisłe związanie polimerazy. • Na obszarze -10 pz następuje rozplatanie podwójnej helisy DNA

7. Inicjacja i elongacja transkrypcji u prokariontów • Podjednostka sigma odłącza się od czterech pozostałych podjednostek polimerazy. • Polimeraza kontynuuje transkrypcję

8. System regulacji operonowej u bakterii

9. Represor lambda (helix-turn-helix)

10. Elementy regulatorowe genów eukariotycznych

11. Białka związane z transkrypcją u eukariontów należą do 4 zróżnicowanych funkcjonalnie grup • 1. Podstawowy aparat transkrypcyjny i związane z nim ogólne czynniki transkrypcyjne (GTF - General Transcription Factors) • 2. Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF). • 3. Duże wielo-podjednostkowe kompleksy koaktywatorów i innych kofaktorów. • 4.Białka związane z chromatyną

12. Podstawowy aparat transkrypcyjny i związane z nim ogólne czynniki transkrypcyjne (GTF - General Transcription Factors) • Pol II - podjednostkowy holoenzym, wymaga dodatkowych czynników (TFII: A, B, D, E, F, H) dla rozpoznania promotora i inicjacji. • TFIIB – umiejscawia Pol II na promotorze • TFIIH – rozplata DNA • TFIID – podjednostkowy kompleks odpowiedzialny za ogólne rozpoznanie promotora (zawiera TBP i TAFs (TBP-Assiociated Factors – odpowiedzialne za specyficzność i różnorodność odpowiedzi transkrypcyjnych)

13. Funkcja TBP-Associated Factors (TAFs)

14. Duże wielo-podjednostkowe kompleksy koaktywatorów i innych kofaktorów. Białka z AT-hook, zdolne do zginania DNA

15. Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF).

16. Specyficzne w stosunku do sekwencji, wiążące się z DNA czynniki transkrypcyjne (TF) - 2

17. Czynnik transkrypcyjny AP-1 (Leu-Zip)

18. Czynnik transkrypcyjny Sp1

19. Funkcja enhancerów

20. Izolatory rozgraniczają domeny kontrolowane przez różne promotory

21. Meyerowitz 2002

22. Rodziny czynników transkrypcyjnych w Arabidopsis

23. Rodzina Homeobox w Arabidopsis zawiera klasy z różnymi kombinacjami domen białkowych, różnice wynikają też z fiologenezy domeny HB. Specyficzny układ domen (leucine zipper, PHD finger, STAR) wynika z ich mieszania charakterystycznego dla roślin, nie występuje w innych królestwach (Drosophila, C. elegans, drożdże). Białka ZF-HB mają specyficzny tylko dla roślin motyw koordynujący cynk. Rodziny Homeobox (HB) i Zinc-Finger-Homeobox (ZF-HB) w Arabidopsis

24. Porównanie rodzin czynników transkrypcyjnych u eukariontów

25. Zawartość i rozkład rodzin czynników transkrypcyjnych u eukariontów

26. Rodzina czynników transkrypcyjnych: AP2/EREBP i profile ekspresyjne z mikromacierzy dla różnych części i organów. Wzrost transkrypcji: czerwone – ponad 8-krotny, różowe - 2- do 8-krotny; żółte - ±2-krotny; Spadek transkrypcji: zielone ponad 2-krotny. Brak transkrypcji – szare.

28. Chromatyna w regulacji transkrypcji

32. Chromatin regulators act as common modifiers of diverse signaling pathways • Systematic mapping of genetic interactions in C. elegans identified six ‘hub’ genes that enhance the phenotypic consequences of mutations in many different pathways. • All six hub genes encode components of chromatin modifying complexes. • Chromatin modifiers may function as genetic buffers (similar to hsp90) preventing cumulation of effects of mutations in multiple functionally unrelated genes and in many otherwise unlinked pathways. Interaction network for EGF signaling. Lehner et al. Nature Genet. (2006)

33. Lokalizacja ogonów histonowych w nukleosomie H4 H4 H3 H3 H2A H2A H2B H2B

34. Acetylacja lizyny

35. Lysine acetylation Serine Phosphorylarion Arginine Methylation Lysine Methylation Modyfikacje histonów ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPH DFKTD H3 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLAR KRKTV H4

36. Lysine acetylation Serine Phosphorylarion Arginine Methylation Lysine Ubiquitination Modyfikacje histonów SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAGLQFPVGRV PKKTE H2A PEPSKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRK VTKYT H2B Lysine Methylation

37. Kod histonowy

38. Wzór metylacji H3K9 w Arabidopsis DAPI aH3K9 After Jackson et al., Chromosoma 112: 308-315

39. min. 0 15 30 45 60 90 120 3% aktyna 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. Tsi1 NtC7 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. osmotyna 0 5 10 15 20 30 45 60 90 min. 0 5 10 15 20 30 45 60 90 min. Analiza odpowiedzi tytoniowych komórek BY-2 na 250mM NaCl 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. anty-fosfo(S10)-H3 anty-fosfo(S10)-acetyl(K14)-H3 0 5 10 15 20 30 45 60 90 120 min. anty-acetyl-H4 intensywność sygnału western-blot, wyrażonaw jednostkach umownych, przypadająca na ilość białka

40. 0 15 30 60 90 min. 0 15 30 60 90 min. DREB1A DREB2A RD29A COR15A aktyna 0 15 30 60 90 kontrola pozytywna Analiza odpowiedzi linii Arabidopsis thaliana T87 na 250mM NaCl 0 15 30 60 90 min. anty-fosfo(S10)-H3 0 15 30 60 90 min. anty-fosfo(S10)-acetyl(K14)-H3 intensywność sygnału western-blot, wyrażonaw jednostkach umownych, przypadająca na ilość białka

41. Metylacja cytozyn w DNA • Reaction: • Cytosine → 5-methylcytosine (5mC) • Enzymes: • Diverse group of DNA methyltransferases (Dnmt’s) • Sequence context: • CpG – animals • CpG (major), CpNpG, CpNpNp - plants

42. Kingston, R.E., Narlikar, G.J.Genes&Development 13:2339-2352(1999) ATP dependent Chromatin Remodeling

43. ATPases of DEXD/H family are motor subunits of chromatin remodeling complexes DEXD/H HelicC DEXD/H HelicC SNF2_N

44. Swp73 Snf2 ISWI Mi2 ISWI Swi3 Swi3 Snf5 Major types of ATP-dependent chromatin remodeling complexes SWI/SNF ISWI Mi2 ATPase Bromodomain ATPase SANT/SLIDE ATPase Chromodomain

45. Visualization of the remodeling activity: ‘sliding assay’ with nucleosomes reconstituted on 248bp rDNA End position Center position

46. Sliding ofnucleosomes induced by Arabidopsis ATPase DDM1 (Decrease in DNA Methylation 1) -ATP DDM1 -ATP DDM1 A B Brzeski&Jerzmanowski J.Biol.Chem. 2003

47. Modyfikacje histonów w aktywacji i wyciszaniu tranaskrypcji

48. Interferencja RNA (RNAi) w ustanawianiu stanu nieaktywnej chromatyny

50. Chromatynowy system aktywacji i hamowania transkrypcji From: Stevenson & Jarvis