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DNA 的提取

DNA 的提取. 田秀君. 鉴于从现场收集的麻风标本多为全血，皮肤活检标本，鼻拭子，因此着重介绍从全血，皮肤活检标本中提取 DNA 的方法。. 实验一 皮肤组织中的 DNA 的提取. 实验目的： 掌握从皮肤组织中提取麻风基因组 DNA 的方法 原理及应用： 麻风基因组 DNA 通常先用 SDS 裂解，蛋白酶 K 消化细胞，利用酚，酚 / 氯仿抽提纯化，经异丙醇或乙醇沉淀，获得基因组 DNA 。适用于 PCR 扩增， Southern 分析等实验。.

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DNA 的提取

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Presentation Transcript

  1. DNA的提取 田秀君

  2. 鉴于从现场收集的麻风标本多为全血，皮肤活检标本，鼻拭子，因此着重介绍从全血，皮肤活检标本中提取DNA的方法。鉴于从现场收集的麻风标本多为全血，皮肤活检标本，鼻拭子，因此着重介绍从全血，皮肤活检标本中提取DNA的方法。

  3. 实验一 皮肤组织中的DNA的提取

  4. 实验目的：掌握从皮肤组织中提取麻风基因组DNA的方法实验目的：掌握从皮肤组织中提取麻风基因组DNA的方法 • 原理及应用：麻风基因组DNA通常先用SDS裂解，蛋白酶K消化细胞，利用酚，酚/氯仿抽提纯化，经异丙醇或乙醇沉淀，获得基因组DNA。适用于PCR扩增，Southern分析等实验。

  5. 商品化的试剂盒不需要酚/氯仿纯化，乙醇沉淀，而是将皮肤组织经裂解液裂解，将裂解后的液体进入含硅藻滤膜的纯化柱，基因组DNA被吸附，洗液穿过纯化柱被抽走。这种方法具有快速，简便，安全的优势。商品化的试剂盒不需要酚/氯仿纯化，乙醇沉淀，而是将皮肤组织经裂解液裂解，将裂解后的液体进入含硅藻滤膜的纯化柱，基因组DNA被吸附，洗液穿过纯化柱被抽走。这种方法具有快速，简便，安全的优势。

  6. 方法一： • 使用商品化的试剂盒提取基因组DNA

  7. 实验材料一 试剂盒成分:QIAamp DNA Blood Mini Kit

  8. 二，其他试剂，仪器及耗材 • 1.5ml的离心管 • 旋涡混合器 • 55℃水浴箱 • 台式离心机（14000 rpm) • 96-100%乙醇 • 0.8%琼脂糖凝胶及电泳装置

  9. 实验步骤 • 准备样本 将皮肤组织标本从70%的酒精中取出，放入1 ×TE中浸泡1小时，取出后用消毒的剪刀，镊子将其剪成肉泥状。

  10. 消化样本 将肉泥状的皮肤组织放入EP管中，加入消化液ATL180ul和蛋白酶K20ul,55 ℃消化大约72h，期间用旋涡混合器振荡混合助溶。消化好的样本成清亮透明。

  11. 加入200ul的溶液AL，旋涡混合均匀 70 ℃孵育10min,加热灭活蛋白酶K 加入200ul的（96-100%）的乙醇，旋涡混合数秒 轻轻的将离心管内的混合物转移到 离心柱内（切勿接触到离心柱沿）， 盖上管盖，8000rpm离心1分钟

  12. 将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内， 将含有过滤物的旧管丢弃 加入500ul的溶液AW1， 8000rpm离心1分钟 将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内， 将含有过滤物的旧管丢弃

  13. 加入500ul的溶液AW2， 14000rpm离心3分钟 将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内， 将含有过滤物的旧管丢弃

  14. 洗脱基因组DNA 将离心柱置于一个干净的1.5ml 的离心管内， 将含有过滤物的旧管丢弃 加50ul的溶液AE 室温孵育5分钟

  15. 8000rpm离心1分钟 • 离心后的管底溶液即为所提取的DNA • 检测：琼脂糖凝胶电泳法观察基因组DNA

  16. 实验二 从全血中提取DNA

  17. 实验目的：掌握从人的全血中提取基因组DNA的方法。实验目的：掌握从人的全血中提取基因组DNA的方法。 • 原理及应用：大体与从皮肤组织中提取的原理及应用相同。

  18. 实验材料一 试剂盒成分:DNeasy Tissue Kit

  19. 实验步骤 • （一）准备样本 将冻存在-40 ℃的样本取出，在37 ℃水浴中迅速解冻，融化。

  20. 离心法纯化基因组DNA 在1.5ml 的离心管底加入20ul的蛋白酶 在离心管中加入200ul的全血 再加入200ul的溶液AL，旋涡混合15秒 56℃孵育10分钟

  21. 瞬时离心将离心管盖上的样品甩下来 加入200ul的（96-100%）的乙醇， 旋涡混合15秒。瞬时离心。 下述步骤同从皮肤组织中提取DNA

  22. 提取鼻拭子DNA的方法 刘健

  23. 在1.5ml Ep管中放入500ul PBST .将鼻拭子棉花端剪下，放入Ep管中， 使其棉花端完全浸入PBST中 将Ep管放入4°C冰箱静置4-6小时 从冰箱中取出Ep管，挤干鼻拭子 的水分，并弃去鼻拭子

  24. 将Ep管放入4°C离心机， 离心20min，13000转 取出Ep管，小心地吸去 上清，保留沉淀 加入50ul 0.1M的Tris-Hcl/EDTA， 反复冻融（-40°C---90°C）3次 加入10ul 20ug/ml蛋白酶K， 在56°C水浴箱中孵育过夜

  25. 在放入100°C中灭活10min 放入-20°C冰箱中保存

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