D tection des anticorps anti adnnatif pour le diagnostic du lupus eryth mateux syst mique
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Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique PowerPoint PPT Presentation


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Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique. Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage Immuno-enzymatique et d'un Test de Farr. Lupus signifie «  loup  » en latin  formes cutanées. Prévalence de 15 à 200 pour 100 000 habitants ;

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Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique

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Presentation Transcript


Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique

Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage Immuno-enzymatique et d'un Test de Farr.


Lupus signifie « loup » en latin  formes cutanées

Prévalence de 15 à 200 pour 100 000 habitants ;

Fréquence plus élevée chez les sujets non caucasiens ;

Prédominance féminine :

8 à 9 femmes pour un homme ;

Pic de fréquence entre 20 et 30 ans ;

Étiologies : facteurs génétiques, endocriniens, immunitaires environnementaux…

Historique et épidémiologie de la maladie lupique

Éruption en ailes de papillon (Hebra 1845)

Mais présence aussi de complications viscérales…


Diagnostic clinique de la maladie lupique

  • Définition de Dubois : « Syndrome clinique

  • de cause inconnue,

  • avec atteinte systémique

  • touchant un ou plusieurs appareils

  • évoluant par poussées,

  • entrecoupé de rémissions multiples ».

  • Critères de gravité de la maladie :atteinte rénale, cardiaque, neurologique, hématologique (AHAI, purpura thrombopénique);


Anomalies biologiques diverses:

1) Signes hématologiques :

anémie, leucopénie, thrombopénie

2) Signes inflammatoires :

- Hyperglobulinémie polyclonale

- Dissociation VS, CRP ;

3) Cryoglobulinémie (III) ;

4) Activation du complément :

CH50, C3, C4 (C1q).

Grande diversité d’auto-Ac:

- Ac antinucléaires

les plus spécifiques :

- anti-ADNnatif(40 à 90%)

- anti-Sm (5 à 30%)

- anti-PCNA (3 à 5%),

- Ac anti-phospholipides

(20 à 40% des lupus),

- Ac anti-cellules sanguines

- Facteur rhumatoïde (30%)

Diagnostic biologique de la maladie lupique


Critères de classification de l’ACR

1 Éruption malaire en ailes de papillon

2 Lupus discoïde

3 Photosensibilité

4 Ulcérations buccales et nasopharyngées

5 Polyarthrite non érosive

6 Pleurésie ou péricardite

7 Atteinte rénale : protéinurie 0.5 g/24 h, cylindres urinaires

8 Atteinte neurologique : convulsions, psychose (sans médicaments inducteurs)

9 Atteinte hématologique : Anémie hémolytique avec hyper-réticulocytose

ou leucopénie  4 000/mm3 constatée au moins à 2 reprises

ou lymphopénie  1 500/mm3 constatée au moins à 2 reprises

ou thrombopénie  100 000/mm3 en l'absence de cause médicamenteuse

10 Désordre immunologique :anticorps anti-ADN natif, anticorps anti-Sm, anticorps anti-phospholipides (soit anti-cardiolipine de type IgG ou IgM à taux élevés, ou anticoagulant circulant lupique, ou sérologie syphilitique dissociée)

11 Présence d'un titre anormal d'anticorps anti-nucléaires.


Seuls les Ac anti-ADN natif sont spécifiques du LES :

  • Rôle dans la pathogénie :

    IgG et de haute avidité Atteintes rénales

    IgM et de faible avidité Faible activité de la maladie

  • Intérêt dans le diagnostic :

    - Taux élevés = Forte valeur prédictive (94%) mais attention!!

    - Diagnostic différentiel de lupus induit (Ac anti-ADNn <5%)

  • Intérêt dans le suivi :

    - Évolutivité : Taux élevés = Indice pronostic péjoratif

    8 à 35% de lupus quiescents avec Ac anti-ADNn à taux élevés;

    - Prise en charge thérapeutique.

Les Anticorps anti-ADN natif

  • Ac anti-ADN natif = Anticorps anti-nucléaires dirigés contre l’ADN du nucléosome. Il existe 3 types d’Ac anti-ADN:

    - Ac anti-ADN natif dirigés contre l’ADNdb seul ou l’ADNdb et l’ADNsb ;

    - Ac anti-ADN dénaturé dirigés uniquement contre l’ADNsb.

Discordances :

Pas de règle

100% établie!!


Aspect nucléaire homogène sur cellules HEp-2

Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif

  • Recherche des anticorps anti-nucléaires par : Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2.

  • Confirmation de la spécificité « anti-ADNn » et dosage par

    3 méthodes distinctes :

    • Test de Farr

    • Immunofluorescence sur Crithidia luciliae

    • Technique ELISA


Test de Farr (RIA)

IFCL

ELISA

Sensibilité

+++

++

++++

Spécificité

+++

++

+/-

Avantages

-Technique quantitative

-Méthode en phase liquide

- Test de référence

-Spécifique de l'ADN natif,

-Simple à mettre en oeuvre

-Technique quantitative,

-Facilité d'emploi,

-Faible coût

Inconvénients

-Présence possible d'ADN dénaturé en solution

-Utilisation de radioisotopes

-Technique semi-quantitative,

-Lecture subjective

-Phénomène de zone

Présence possible d'ADN dénaturé contaminant

Interférences

Héparines,Dextrans,

Polyanions

Ac anti-histones

Viroses,

Syndrome des

anti-phospholipides

Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif


Objectifs de ce travail

  • Enquête rétrospective :

    Évaluation des performances de 7 coffrets de dosage immuno-

    enzymatique des Ac anti-ADN natif par rapport au test de Farr

    utilisé en routine dans le laboratoire d’Immunologie du CHRU

    de Lille.


Critères biologiques de sélection des 80 sérums :

76 sérums avec un titre en anticorps anti-nucléaires 1/320e en IFI :

43 sérumsFarr +

33 sérums Farr –

4 sérums avec taux d’alpha foeto-protéine (AFP) 4000g/L (seuil à 10g/L)

Répartition clinique :

70 pathologies auto-immunes :

53 lupiques :

17 non lupiques = autres maladies

auto-immunes (SAPL, GS, myasthénie)

10 autres pathologies (Raynaud, pneumopathie, hépatopathie)

Sérums et patients

N=44Sex ratio(F/H)=93%

Age=15-78 ans (moyenne 42ans)

Sévérité : Forme bénigne 18% (8/44)

Forme modérée 48% (21/44)

Forme grave 34% (15/44)

Traitement : 43/44 (97%)

Association à d’autres MAI : 45.5% (20/44)


Les 7 coffrets ELISA :

- Test 1 : société Bio Advance,

- Test 2 : société Sanofi Pasteur Diagnostics (Biorad),

- Test 3 et 4 : société BMD,

- Test 5 : société The binding site,

- Test 6 : société Menarini Diagnostics,

- Test 7 : sociétéPharmacia & Upjohn.

Test de Farr : Société

Ortho Clinical Diagnostic

Méthodologie identique :

1) Incubation des sérums dans les puits coatés d’ADNbicaténaire,

2) Lavage,

3) Incubation en présence du conjugué,

4) Lavage,

5) Incubation en présence du substrat,

6) Révélation (lecture de DO).

Mais différences entre les trousses :

- Nature de l’antigène, de l’anticorps ;

- Autres : temps d’incubation, dilution

des sérums, nombre de calibrants,

DO de référence et la valeur seuil…

Calcul d’un seuil arbitraire

Matériel et méthodes


Dosages des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les patients lupiques

220

110

100

90

80

70

UI/mL

60

50

40

30

20

Seuil arbitraire

10

0

Farr

Sanofi

BMD a

BMD b

Menarini

Pharmacia

BioAdvance

The Binding site


Dosage des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les patients non-lupiques

220

110

100

90

80

UI/mL

70

60

50

40

30

20

Seuil arbitraire

10

0

Farr

Sanofi

BMD a

BMD b

Pharmacia

Menarini

BioAdvance

The Binding site


Sensibilité (%)

Spécificité (%)

100

80

60

40

20

0

Farr

Indices informationnels

  • Performances du test de Farr : Sensibilité=71%

    Spécificité=78%

    Ac de haute affinité =Maladie lupique évolutive

    • 89% des lupus avec Farr positif = formes modérées ou graves

      Corrélation Titres/ Clinique : seulement entre formes bénignes et graves

  • Discordances clinico-biologiques :

    - 28% lupus avec Farr négatif :

    -supérieur à la littérature (8 à 22%)

    -rarement formes bénignes

    -découverte récente

    -souvent atteinte articulaire

    -lupus traité

    - 18% non-lupiques avec Farr positif :

    -SAPL le plus souvent

  • Contre performance?

    Phase pré-sérologique?

    Lupus éteints ou stabilisé sous traitement?

    Phase pré-clinique de lupus biologique?


    Sensibilité (%)

    Spécificité (%)

    100

    80

    60

    40

    20

    0

    Sanofi

    Farr

    BMD a

    BMD b

    Menarini

    BioAdvance

    Pharmacia

    The Binding site

    Indices informationnels


    Comparaison Méthodes ELISA / Test de Farr

    • Concordance des résultats : MODESTE

      - Dans la population lupiquede 43 à 73%,

      - Dans la population non lupique de 34 à 82%,

      - Meilleure concordance globale avec les tests 2 (68%) et 7 (67%).

    • Corrélation des titres d’Ac anti-ADNn dans la population lupique : ACCEPTABLE

      - Coefficient de corrélation de 0.24 à 0.67,

      - Meilleure avec les tests2 et 6,

      - Meilleure pour les titres élevés en Ac anti-ADN natif.


    - Dans la population non lupique seulement pour 1 sérum (3.7%)!!

    Médiocre avec les 5 coffrets les plus spécifiques : 22%

    • Corrélation des titres avec la clinique : MAUVAISE

      Seule UNE trousse (test 2) titres formes graves/ bénignes

    Comparaison des méthodes ELISA

    • Grande hétérogénéité des résultats obtenus :

      Variation des sensibilités de 15 à 100%

      Variation des spécificités de 15 à 94%

    • Concordance des résultats : MAUVAISE

      - Dans la population lupiqueseulement pour 6 sérums (11%)

      Meilleure avec les 4 coffrets les plus sensibles : 82%


    Manque de standardisation global entre les 7 coffrets même si étalonnés par rapport au même standard international : W0 80

    Diagnostic biologique incohérent entre la majorité des trousses

    Suivi évolutif des patients lupiques non adapté par méthode ELISA

    Origines des discordances :

    Facteurs extérieurs?

    Défaut intrinsèque?

    - Phase solide=manque de spécificité,

    - Imperfections des microplaques,

    - Ac anti-plastique.

    Différences entre les trousses?

    - Nombre d’étalons pour la calibration,

    - Nature du réactif conjugué (antiglobuline),

    - Origine de l’Ag.

    Comparaison des méthodes ELISA


    Interférences

    • Ac anti-Histones/ Ac anti-ADN dénaturé :

      Résultats faux positifs avec 6 coffrets

      (Farr négatif et patients non lupiques).

    • AFP :

      Interférences avec 4 coffrets (tests 3, 4, 5 et 7)

    • Ac anti-phospholipides :

      Résultats positifs avec 5 coffrets (sauf tests 5 et 6 )

      Phase solide favorise les réactions croisées entre Ac anti-phospholipides et ADN,

      Or test de Farr positif pour 4 de ces sérums : présence probable d’Ac anti-ADNn Phase pré-clinique de lupus?

    • Facteur rhumatoïde et cryoglobuline:

      Non représentatif dans notre enquête.


    Intérêt d’une démarche biologique hiérarchisée

    • Recherche d’anticorps anti-nucléairespar IFI : Présents dans 99 à 100% des lupus

      mais non spécifiques de la maladie

      (connectivites, affections inflammatoires, sujet âgé)

    =Test de 1ère intention

    Aspect homogène en IFI avec titre1/320e

    Recherche d’Ac anti-ADNn

    Détection par

    -

    +

    Méthodes ELISA

    IF-CL

    Adapter selon dialogue clinico-biologique

    Confirmation par test de Farr

    • Suivi évolutif : Test de Farr détecte une augmentation des Ac anti-ADNn

      dans 85% des cas de rechutes contre 75% pour ELISA et 63% pour l’IF-CL

      Associer d’autres paramètres biologiques : CH50 et fractions…


    Conclusion

    • Aucun coffret commercial ELISA n’atteint les performances du test de Farr car :

      - Problèmes techniques

      - Encore trop de discordances et d'interférences

      - Absence de corrélation entre titre et sévérité clinique

      Choisir un coffret fiable

      Confirmation par test plus spécifique

      Importance du dialogue clinico-biologique…


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